Generación y cultivo de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado

Resumen

Los organoides derivados del paciente (PDO) son un cultivo tridimensional (3D) que puede imitar el entorno tumoral in vitro. En el cáncer de ovario seroso de alto grado, las PDO representan un modelo para estudiar nuevos biomarcadores y terapias.

Resumen

Los organoides son modelos tumorales dinámicos 3D que se pueden cultivar con éxito a partir de tejido tumoral ovárico derivado del paciente, ascitis o líquido pleural y ayudan en el descubrimiento de nuevas terapias y biomarcadores predictivos para el cáncer de ovario. Estos modelos recapitulan la heterogeneidad clonal, el microambiente tumoral y las interacciones célula-célula y célula-matriz. Además, se ha demostrado que coinciden con el tumor primario morfológicamente, citológicamente, inmunohistoquímicamente y genéticamente. Por lo tanto, los organoides facilitan la investigación sobre las células tumorales y el microambiente tumoral y son superiores a las líneas celulares. El presente protocolo describe distintos métodos para generar organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes a partir de tumores de pacientes, ascitis y muestras de líquido pleural con una tasa de éxito superior al 97%. Las muestras de pacientes se separan en suspensiones celulares mediante digestión mecánica y enzimática. Luego, las células se colocan utilizando un extracto de membrana basal (BME) y se apoyan con medios de crecimiento optimizados que contienen suplementos específicos para el cultivo de cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC). Después de formar organoides iniciales, los PDO pueden sostener el cultivo a largo plazo, incluido el paso por expansión para experimentos posteriores.

Introducción

En 2021, aproximadamente 21,410 mujeres en los Estados Unidos fueron diagnosticadas recientemente con cáncer epitelial de ovario, y 12,940 mujeres murieron de esta enfermedad¹. Aunque se han logrado avances suficientes en cirugía y quimioterapia, más de 70% de los pacientes con enfermedad avanzada desarrollan resistencia quimioterapéutica y mueren dentro de los 5 años posteriores al diagnóstico ^2,3. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas estrategias para tratar esta enfermedad mortal y modelos representativos y confiables para la investigación preclínica.

Las líneas celulares cancerosas y los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) creados a partir de tumores ováricos primarios son los principales instrumentos utilizados en la investigación del cáncer de ovario. Una ventaja importante de las líneas celulares de cáncer es su rápida expansión. Sin embargo, su cultivo continuo da como resultado alteraciones fenotípicas y genotípicas que hacen que las líneas celulares cancerosas se desvíen de la muestra original del tumor primario de cáncer. Debido a las diferencias existentes entre la línea celular del cáncer y el tumor primario, los ensayos farmacológicos que tienen efectos positivos en las líneas celulares no tienen los mismos efectos en los ensayos clínicos². Para superar estas limitaciones, se utilizan modelos PDX. Estos modelos se crean mediante la implantación de tejido fresco de cáncer de ovario en ratones inmunodeficientes. Como son modelos in vivo , se parecen con mayor precisión a las características biológicas humanas y, a su vez, son más predictivos de los resultados de los medicamentos. Sin embargo, estos modelos también tienen limitaciones significativas, incluyendo el costo, el tiempo y los recursos necesarios para generarlos⁴.

Las PDO ofrecen un modelo alternativo para la investigación preclínica que supera las limitaciones tanto de las líneas celulares cancerosas como de los modelos PDX. Las PDO recapitulan el tumor y el microambiente tumoral de un paciente y, así, proporcionan un modelo intratable in vitro ideal para la investigación preclínica ^2,3,5. Estos modelos 3D tienen capacidades de autoorganización que modelan el tumor primario, que es una característica que sus contrapartes de línea celular bidimensional (2D) no poseen. Además, se ha demostrado que estos modelos representan genética y funcionalmente sus tumores progenitores y, por lo tanto, son modelos confiables para estudiar nuevos procesos terapéuticos y biológicos. En resumen, ofrecen capacidades de expansión y almacenamiento a largo plazo similares a las líneas celulares, pero también abarcan el microambiente y las interacciones célula-célula inherentes a los modelos de ratón ^4,6.

El presente protocolo describe la creación de PDOs a partir de tumores derivados de pacientes, ascitis y muestras de líquido pleural con una tasa de éxito superior al 97%. Los cultivos PDO pueden expandirse durante múltiples generaciones y usarse para probar la sensibilidad a la terapia farmacológica y los biomarcadores predictivos. Este método representa una técnica que podría utilizarse para personalizar los tratamientos en función de las respuestas terapéuticas de las DOP.

Protocolo

Todas las muestras de tejido humano recolectadas para la investigación se obtuvieron de acuerdo con el protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB). Los protocolos descritos a continuación se realizaron en un entorno estéril de cultivo de tejidos humanos. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de sujetos humanos. Las pacientes elegibles tenían que tener un diagnóstico o presunto diagnóstico de cáncer de ovario, estar dispuestas y ser capaces de firmar el consentimiento informado y tener al menos 18 años de edad. El tejido tumoral (tumor primario maligno o sitios metastásicos), la ascitis y el líquido pleural se obtuvieron de pacientes que dieron su consentimiento en el momento del procedimiento. Estas muestras fueron transportadas inmediatamente al laboratorio y procesadas para la generación de organoides utilizando los métodos descritos a continuación.

1. Preparación de los medios

1. Preparación completa de los medios organoides
   1. Preparar R-spondin 1/medio acondicionado Noggin siguiendo un informe previamente publicado⁷.
      NOTA: El medio condicionado R-spondin-1/Noggin es una alternativa más asequible a las proteínas recombinantes disponibles comercialmente. Las células HEK293T que secretan de manera estable R-spondin-1 y Noggin a través de la transducción mediada por lentivirus fueron un generoso regalo de Ron Bose, de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington en St. Louis, y Anil Rustgi, New York-Presbyterian/Columbia University Irving Medical Center ^8,9,10. El medio acondicionado comercial podría usarse como sustituto (ver Tabla de materiales).
2. Para hacer el medio organoide completo, combine 10% de R-spondina 1/medio condicionado con Noggin, 50 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF-10, 10 ng/mL FGF2, 1x B27, 10 mmol/L nicotinamida, 1.25 mmol/L N-acetilcisteína, 1 μmol/L de prostaglandina E2, 10 μmol/L SB202190, 500 nmol/L A83-01 e inhibidor de ROCK de 10 μM (ver Tabla de materiales).
   NOTA: El medio puede conservarse a 4 °C durante un máximo de 3 meses. Este medio fue adaptado de Hill et ^al.11. Las concentraciones e ingredientes del medio son los mismos, con la adición de un inhibidor de ROCK.
3. Prepare el medio base organoide combinando 500 ml de una formulación avanzada de DMEM/F12 con 1% de penicilina-estreptomicina, 1x dipéptido, L-alanil-L-glutamina y 1x HEPES (10 mM) (ver Tabla de materiales).

2. Recolección de organoides de ascitis y líquido pleural

NOTA: La ascitis y el líquido pleural deben procesarse lo antes posible para obtener el mejor rendimiento de los organoides. Descongele el tampón de reacción de BME, DNasa I y DNasa I previamente acitado (consulte la Tabla de materiales) colocándolo en hielo hasta que el contenido se licúe.

1. Obtenga ascitis y líquido pleural de los pacientes que dan su consentimiento en el momento de las cirugías o procedimientos de atención estándar, y transporte a temperatura ambiente en un contenedor de viaje al laboratorio.
   NOTA: Toda ascitis o procesamiento de líquido pleural debe realizarse en un ambiente estéril.
2. Transfiera 50 ml de ascitis o líquido pleural a 50 ml de tubos cónicos (el número de tubos depende del volumen de ascitis obtenido). Centrifugadora a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Después de la centrifugación, utilice una pipeta de vidrio Pasteur para aspirar cuidadosamente el sobrenadante.
3. Continuar añadiendo 50 ml de ascitis o líquido pleural al pellet previamente centrifugado, y centrifugar de nuevo a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur. Repita este paso hasta que se hayan procesado todas las ascitis o el líquido pleural.
4. Preparar una solución de DNasa I de 100 μg/ml combinando 1.000 μL de agua libre de nucleasa, 100 μL de tampón de reacción de la DNasa I y 10 μL de DNasa I.
   NOTA: El tratamiento con DNasa I aplicado es suficiente para hacer una suspensión unicelular independientemente de la presencia de agregados celulares en algunas muestras de pacientes¹².
5. Resuspender cada pellet celular en 1 mL de solución de DNasa I de 100 μg/mL. Agregue suavemente la solución de DNasa I gota a gota y deje que el tubo se incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Agregue un mínimo de 1 ml de solución de DNasa I. Si 1 ml no es suficiente para perturbar el pellet, agregue 1 ml adicional.
6. Después de la incubación, añadir 25 ml de medio base organoide (paso 1.3) a las células, e invertir suavemente para mezclar. A continuación, centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.
7. Resuspenda los gránulos de células recién formados en 5 ml precalentados de 1x tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) (consulte la Tabla de materiales). Ajuste el vórtice a 458 x g y vortice las soluciones en cada tubo cónico. Una vez que las soluciones sean homogéneas, utilice una pipeta serológica para combinar el contenido de todos los tubos cónicos en un solo tubo cónico de 50 ml.
8. Incubar el tubo cónico que contiene la solución vortexed a temperatura ambiente durante 5 min. Una vez finalizada la incubación, centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C.
   NOTA: Examine el pellet. Un pellet rosa/rojo indica la presencia de glóbulos rojos, lo que requeriría que el paso de amortiguación de lisis de glóbulos rojos se repita hasta que el pellet ya no sea rojo.
9. Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur. A continuación, lavar el pellet con 10 ml de PBS, vaporizar la solución a 458 x g y centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C.
10. Si se forma un pellet de células grandes, aspirar el PBS con una pipeta de vidrio Pasteur y añadir 1 ml de medio base organoide (paso 1.3) encima del pellet. Vortex la solución a 458 x g y transferir 300-400 μL a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar el tubo de microcentrífuga a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: La porción del pellet celular no colocada en el tubo de microcentrífuga se puede congelar para su uso futuro (500 μL de células a 1 ml de DMSO al 10% en FBS). El pellet de celda congelada se puede almacenar durante semanas a -80 ° C y durante años si se coloca en nitrógeno líquido¹³.
11. Aspirar cuidadosamente el medio base organoide (paso 1.3) con una pipeta de vidrio Pasteur y resuspender en BME (ver Tabla de materiales) utilizando puntas frías.
    NOTA: La cantidad de BME se basa en el tamaño del pellet. Se recomienda utilizar un 25% de medio base organoide (paso 1.3) con células resuspendidas al 75% de BME.
12. Placa 40 μL alícuotas de la solución celular resuspendida en una placa de 6 pocillos. Placa de hasta cinco alícuotas por pocillo (Figura 1).
13. Colocar inmediatamente la placa en una incubadora a 37 °C durante 20 minutos para permitir que el BME se solidifique. Después de la incubación, añadir suavemente 2 ml de medio organoide completo (paso 1.2) en cada pocillo.

Figura 1: Recubrimiento de organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes. Imagen representativa del revestimiento organoide. Las alícuotas de la mezcla de organoides se chapan cuidadosamente, asegurando que no se formen burbujas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Recolección de organoides de tejidos

NOTA: El tejido debe procesarse lo antes posible para obtener el mejor rendimiento de los organoides.

1. Recolectar y transportar el tumor en hielo en un recipiente de viaje que contenga PBS.
2. Colocar la muestra en una placa de cultivo de tejido de 10 cm (Figura 2). Usando un bisturí desechable, pica el tejido. A continuación, utilizando el extremo opaco de una jeringa desechable, aplaste el tejido hasta que se haya creado una mezcla homogénea.
3. Usando fórceps, coloque la mezcla de tejido homogéneo en un tubo de disociación. Por cada 1-2 ml de tejido homogeneizado, añadir 7-8 ml de solución de colagenasa tipo II de 1 mg/ml (ver Tabla de materiales) en medio base organoide (paso 1.3) y 1 ml de solución de DNasa I. Vortex la solución a 458 x g.
   NOTA: La cantidad de tejido determinará la cantidad de solución de colagenasa y la cantidad de tubos necesarios.
4. Use la máquina de disociación (consulte la Tabla de materiales) para licuar el tejido mientras está en la solución de colagenasa. Ejecute el programa 37C_h_TDK3 (1 h) hasta que sea una suspensión de una sola celda.
   NOTA: Será necesario volver a ejecutar el programa si la mezcla resultante no es homogénea (es decir, si todavía hay trozos de tejido presentes en la mezcla). Si el tejido se digiere pero la solución es viscosa, diluir con medio base organoide (paso 1.3).
5. Transfiera la mezcla homogeneizada a un nuevo tubo cónico de 50 ml y añada 20-40 ml de medio base organoide (paso 1.3). Luego, filtre la solución a través de un filtro celular de 100 μm en un tubo cónico de 50 ml recién etiquetado.
6. Centrifugar la mezcla filtrada a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Luego, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.
7. Preparar una solución de DNasa I de 100 μg/ml combinando 1.000 μL de agua libre de nucleasa, 100 μL de tampón de reacción de la DNasa I y 10 μL de DNasa I.
   NOTA: El tratamiento con DNasa I aplicado es suficiente para hacer una suspensión unicelular independientemente de la presencia de agregados celulares en algunas muestras de pacientes¹².
8. Resuspender las células en 1 ml de solución de DNasa I de 100 ug/ml. Agregue suavemente la solución de DNasa I gota a gota y deje que el tubo se incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.
9. Después de la incubación, añadir 25 ml de medio base organoide (paso 1.3) a las células, e invertir suavemente para mezclar. A continuación, centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.
10. Resuspender el pellet celular recién formado en 5 ml de tampón de lisis 1x RBC precalentado. Vortex las soluciones en cada tubo cónico a 458 x g.
11. Incubar el tubo cónico que contiene el pellet celular resuspendido en el tampón de lisis RBC durante 5 min. Una vez finalizada la incubación, centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: Examine el pellet. Un pellet rosa / rojo indica la presencia de glóbulos rojos, lo que requeriría que el paso de amortiguación de lisis de glóbulos rojos se repita hasta que el pellet aparezca blanco.
12. Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur. A continuación, lavar el pellet con 10 ml de PBS, vaporizar la solución a 458 x g y centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C.
13. Si se forma un pellet de células grandes, aspirar el PBS con una pipeta de vidrio Pasteur y añadir 1 ml de medio base organoide (paso 1.3) encima del pellet. Vortex la solución a 458 x g y transferir 300-400 μL a un tubo de microcentrífuga. Centrifugadora a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: La porción del pellet celular no colocada en el tubo de microcentrífuga se puede congelar para su uso futuro (500 μL de células a 1 ml de DMSO al 10% en FBS) (paso 5.1). El pellet de celda congelada se puede almacenar durante semanas a -80 ° C y durante años si se coloca en nitrógeno líquido¹³.
14. Aspirar cuidadosamente el medio base organoide con una pipeta de vidrio Pasteur y resuspender en BME con puntas frías.
    NOTA: La cantidad de BME se basa en el tamaño del pellet. Se recomienda añadir un 25% de medio base organoide (paso 1.3) con células resuspendidas al 75% de BME.
15. Colocar la solución celular resuspendida en una placa de 6 pocillos en alícuotas de 40 μL. Planchar hasta cinco alícuotas por pozo.
16. Coloque inmediatamente la placa del pozo en la incubadora durante 20 minutos. Después de la incubación, añadir suavemente 2 ml de medio organoide completo (paso 1.2) en cada pocillo.

Figura 2: Tejido tumoral antes de la disección. Imagen representativa del tejido tumoral obtenido para la generación de organoides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Paso de organoides

NOTA: Si la muestra es confluente, cada pocillo organoide se puede pasar semanalmente a dos nuevos pocillos.

1. Utilizando una pipeta de 1 ml, añadir 1 ml de medio base organoide (paso 1.3) a cada pocillo y pipetear el medio hacia arriba y hacia abajo directamente sobre las lengüetas del organoide para disociarlo. Recoger todo el medio que contiene los pellets resuspendidos en un tubo cónico de 15 ml.
2. Centrifugar el tubo cónico de 15 ml que contiene la mezcla a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Luego, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.
3. Agregue 1 ml de enzima recombinante libre de origen animal (consulte la Tabla de materiales) a la bolita celular, haga un vórtice de la solución a 458 x g y transfiérala a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Dejar que el tubo se incube durante 15 minutos en un baño de agua a 37 °C.
4. Después de la incubación, centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Luego, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.
5. Resuspender el pellet en BME.
   NOTA: La cantidad de BME se basa en el tamaño del pellet. Se recomienda añadir un 25% de medios base organoides (paso 1.3) con células resuspendidas al 75% de BME.
6. Colocar la solución celular resuspendida en una placa de 6 pocillos en alícuotas de 40 μL. Planchar hasta cinco alícuotas por pozo. Una vez que todas las alícuotas hayan sido plateadas, coloque inmediatamente la placa del pozo en la incubadora durante 20 minutos. Después de la incubación, añadir suavemente 2 ml de medio organoide completo (paso 1.2) en cada pocillo.

5. Congelación y descongelación de organoides

1. Congelación de organoides
   1. Comience con los pasos 4.1-4.4.
   2. Resuspender el pellet celular en 0.5-1 ml de medio de congelación de cultivo celular de recuperación (ver Tabla de materiales) y transferir 1 ml a cada criovial.
   3. Luego, coloque los crioviales en un recipiente lleno de isopropanol a -80 °C durante un máximo de 2 semanas antes de transferirlos a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo¹³.
2. Descongelación de organoides
   1. Retirar las muestras del depósito de nitrógeno líquido y descongelar al baño maría a 37 °C.
   2. Una vez descongelado, transferir a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.
   3. Resuspender el pellet en BME.
      NOTA: La cantidad de BME se basa en el tamaño del pellet. Se recomienda añadir un 25% de medios base organoides (paso 1.3) con células resuspendidas al 75% de BME.
   4. Colocar la solución celular resuspendida en una placa de 6 pocillos en alícuotas de 40 μL. Colocar hasta cinco alícuotas por pozo.
   5. Coloque inmediatamente la placa en la incubadora durante 20 minutos. Después de la incubación, añadir suavemente 2 ml de medio organoide completo (paso 1.2) a los pocillos.

6. Incrustación y generación de portaobjetos fijados en parafina (FFPE) para evaluar la composición organoide

1. Después de cultivar organoides durante al menos 10 días para asegurar un tamaño adecuado, retire el medio organoide completo de los pocillos y agregue 1 ml de fijador de paraformaldehído al 2% (PFA). Incubar a temperatura ambiente durante 5-10 min.
2. Después de la incubación, lavar las alícuotas de organoides cultivados 3 veces durante 5 min cada vez con 1 ml de PBS.
3. Retire el PBS de cada pocillo y agregue 1 ml de agar caliente al 2% en H₂O desionizado a cada pocillo. Al agregar el agar, levante las alícuotas organoides cultivadas de la placa con una espátula.
   NOTA: Es importante no dejar que el agar se endurezca antes de levantar las alícuotas organoides cultivadas.
   1. Permita que el agar se solidifique en el pozo a temperatura ambiente.
4. Usando una espátula pequeña, libere el agar solidificado del pozo y guárdelo en un casete hasta 48 h (consulte la Tabla de materiales) a 4 ° C en etanol al 70% hasta el procesamiento¹⁴.
5. Incrustar las muestras en parafina 15, cortar los portaobjetos a un espesor de 5 μm y teñir los portaobjetos con tinción de hematoxilina y eosina (H&E, consulte la Tabla de materiales) utilizando un protocolo estándar¹⁵.

Resultados

Para generar DOP, las muestras se digirieron mecánica y enzimáticamente en suspensiones unicelulares. Las células se resuspendieron en BME y se complementaron con medios específicamente diseñados (Figura 3). Los organoides se establecen típicamente en un marco de tiempo de 10 días, después de lo cual demuestran organoides discretos en cultivo (Figura 4).

Discusión

El cáncer de ovario es extremadamente mortal debido a su etapa avanzada en el momento del diagnóstico, así como al desarrollo común de resistencia a la quimioterapia. Se han logrado muchos avances en la investigación del cáncer de ovario mediante la utilización de líneas celulares cancerosas y modelos PDX; Sin embargo, existe una necesidad evidente de un modelo in vitro más representativo y asequible. Las PDO han demostrado representar con precisión la heterogeneidad tumoral, el microambiente tumoral y...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% HEPES	Life Technologies	15630080
1% Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	30002CI
1.5 mL Eppendorf Tubes	Genesee Scientific	14125
10 cm Tissue Culture Dish	TPP	93100
10 mL Serological Pipet
100 µm Cell Filter	MidSci	100ICS
15 mL centrifuge tubes	Corning	430052
2 mL Cryovial	Simport Scientific	T301-2
2% Paraformaldehyde Fixative	Sigma-Aldrich
37 °C water bath	NEST	602052
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement	Millipore Sigma	SCM104
6 well plates	TPP	92006
70% Ethanol	Sigma-Aldrich	R31541GA
A83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher	12634028
Agar	Lamda Biotech	C121
B-27	Life Technologies	17504044
Centrifuge
Cultrex Type 2	R&D Systems	3533-010-02	basement membrane extract
DNase I	New England Bio Labs	M0303S
DNase I Reaction Buffer	New England Bio Labs	M0303S
EGF	PeproTech	AF-100-15
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
FGF-10	PeproTech	100-26
FGF2	PeproTech	100-18B
gentleMACS C Tubes	Miltenyi BioTech	130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi BioTech	130-096-427	We use the manufacturers protocol.
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	dipeptide, L-alanyl-L-glutamine
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Fisher Scientific	NC1470670
Histoplast Paraffin Wax	Fisher Scientific	22900700
Microcentrifuge
Mr. Frosty Freezing Container	Fisher Scientific	07202363S
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
p1000 Pipette with Tips
p200 Pipette with Tips
Pasteur Pipettes 9"	Fisher Scientific	1367820D
PBS	Fisher Scientific	MT21031CM
Pipet Controller
Prostaglandin E2	R&D Systems	2296
Puromycin	ThermoFisher	A1113802
Recombinant Murine Noggin	PeproTech	250-38
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Invitrogen	12648010
Red Blood Cell Lysis Buffer	BioLegend	420301
ROCK Inhibitor (Y-27632)	R&D Systems	1254/1
SB202190	Sigma-Aldrich	S7076
T75 Flask	MidSci	TP90076
Tissue Culture Hood
Tissue Embedding Cassette
TrypLE Express	Invitrogen	12604013	animal origin-free, recombinant enzyme
Type II Collagenase	Life Technologies	17101015
Vortex