Generazione e coltura di organoidi di alto grado derivati da pazienti con carcinoma ovarico sieroso

Riepilogo

Gli organoidi derivati dal paziente (PDO) sono una coltura tridimensionale (3D) che può imitare l'ambiente tumorale in vitro. Nel carcinoma ovarico sieroso di alto grado, le DOP rappresentano un modello per studiare nuovi biomarcatori e terapie.

Abstract

Gli organoidi sono modelli tumorali dinamici 3D che possono essere coltivati con successo da tessuto tumorale ovarico derivato dal paziente, ascite o liquido pleurico e aiutano nella scoperta di nuove terapie e biomarcatori predittivi per il cancro ovarico. Questi modelli ricapitolano l'eterogeneità clonale, il microambiente tumorale e le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Inoltre, hanno dimostrato di corrispondere al tumore primario morfologicamente, citologicamente, immunoistochimicamente e geneticamente. Pertanto, gli organoidi facilitano la ricerca sulle cellule tumorali e sul microambiente tumorale e sono superiori alle linee cellulari. Il presente protocollo descrive metodi distinti per generare organoidi di cancro ovarico derivati dal paziente da tumori del paziente, ascite e campioni di liquido pleurico con un tasso di successo superiore al 97%. I campioni del paziente vengono separati in sospensioni cellulari mediante digestione meccanica ed enzimatica. Le cellule vengono quindi placcate utilizzando un estratto di membrana basale (BME) e sono supportate con terreni di crescita ottimizzati contenenti integratori specifici per la coltura del carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC). Dopo aver formato gli organoidi iniziali, le DOP possono sostenere la cultura a lungo termine, incluso il passaggio per l'espansione per esperimenti successivi.

Introduzione

Nel 2021, circa 21.410 donne negli Stati Uniti sono state diagnosticate di recente con cancro ovarico epiteliale e 12.940 donne sono morte di questa malattia¹. Sebbene siano stati fatti progressi sufficienti in chirurgia e chemioterapia, oltre il 70% dei pazienti con malattia avanzata sviluppa resistenza chemioterapica e muore entro 5 anni dalla diagnosi ^2,3. Pertanto, sono urgentemente necessarie nuove strategie per trattare questa malattia mortale e modelli rappresentativi e affidabili per la ricerca preclinica.

Le linee cellulari tumorali e gli xenotrapianti derivati dal paziente (PDX) creati da tumori ovarici primari sono i principali strumenti utilizzati nella ricerca sul cancro ovarico. Uno dei principali vantaggi delle linee cellulari tumorali è la loro rapida espansione. Tuttavia, la loro coltura continua provoca alterazioni fenotipiche e genotipiche che causano le linee cellulari tumorali a deviare dal campione di tumore primario originale. A causa delle differenze esistenti tra la linea cellulare tumorale e il tumore primario, i test farmacologici che hanno effetti positivi nelle linee cellulari non riescono ad avere questi stessi effetti negli studi clinici². Per superare queste limitazioni, vengono utilizzati i modelli PDX. Questi modelli sono creati impiantando tessuto fresco del cancro ovarico in topi immunodeficienti. Poiché sono modelli in vivo , assomigliano più accuratamente alle caratteristiche biologiche umane e, a loro volta, sono più predittivi dei risultati dei farmaci. Tuttavia, questi modelli hanno anche limitazioni significative, tra cui il costo, il tempo e le risorse necessarie per generarli⁴.

Le PDO offrono un modello alternativo per la ricerca preclinica che supera i limiti sia delle linee cellulari tumorali che dei modelli PDX. Le PDO ricapitolano il tumore e il microambiente tumorale di un paziente e, quindi, forniscono un modello trattabile in vitro ideale per la ricerca preclinica ^2,3,5. Questi modelli 3D hanno capacità di auto-organizzazione che modellano il tumore primario, che è una caratteristica che le loro controparti bidimensionali (2D) della linea cellulare non possiedono. Inoltre, questi modelli hanno dimostrato di rappresentare geneticamente e funzionalmente i loro tumori genitori e, quindi, sono modelli affidabili per lo studio di nuove terapie e processi biologici. In breve, offrono capacità di espansione e stoccaggio a lungo termine simili alle linee cellulari, ma comprendono anche il microambiente e le interazioni cellula-cellula inerenti ai modelli murini ^4,6.

Il presente protocollo descrive la creazione di DOP da tumori derivati dal paziente, ascite e campioni di liquido pleurico con un tasso di successo superiore al 97%. Le colture DOP possono quindi essere espanse per più generazioni e utilizzate per testare la sensibilità alla terapia farmacologica e i biomarcatori predittivi. Questo metodo rappresenta una tecnica che potrebbe essere utilizzata per personalizzare i trattamenti in base alle risposte terapeutiche delle DOP.

Protocollo

Tutti i campioni di tessuto umano raccolti per la ricerca sono stati ottenuti secondo il protocollo approvato dall'Institutional Review Board (IRB). I protocolli descritti di seguito sono stati eseguiti in un ambiente di coltura di tessuti umani sterili. Il consenso scritto informato è stato ottenuto da soggetti umani. Le pazienti eleggibili dovevano avere una diagnosi o una presunta diagnosi di cancro ovarico, essere disposte e in grado di firmare il consenso informato e avere almeno 18 anni di età. Il tessuto tumorale (tumore primario maligno o siti metastatici), ascite e liquido pleurico sono stati ottenuti da pazienti consenzienti al momento della procedura. Questi campioni sono stati immediatamente trasportati in laboratorio e trattati per la generazione di organoidi utilizzando i metodi descritti di seguito.

1. Preparazione dei supporti

1. Preparazione completa dei media organoidi
   1. Preparare il terreno condizionato R-spondin 1/Noggin seguendo un rapporto precedentemente pubblicato⁷.
      NOTA: Il mezzo condizionato da R-spondina-1/Noggin è un'alternativa più economica alle proteine ricombinanti disponibili in commercio. Le cellule HEK293T che secernono stabilmente R-spondina-1 e Noggin tramite trasduzione mediata da lentivirus sono state un generoso dono di Ron Bose, Washington University School of Medicine di St. Louis, e Anil Rustgi, New York-Presbyterian / Columbia University Irving Medical Center ^8,9,10. Il mezzo commerciale condizionato potrebbe essere utilizzato come sostituto (vedi Tabella dei materiali).
2. Per ottenere il mezzo organoide completo, combinare il 10% di terreno condizionato R-spondina 1/Noggin, 50 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF-10, 10 ng/mL FGF2, 1x B27, 10 mmol/L nicotinamide, 1,25 mmol/L N-acetilcisteina, 1 μmol/L prostaglandina E2, 10 μmol/L SB202190, 500 nmol/L A83-01 e 10 μM inibitore ROCK (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Il terreno può essere conservato a 4 °C per un massimo di 3 mesi. Questo mezzo è stato adattato da Hill et ^al.11. Le concentrazioni e gli ingredienti del mezzo sono gli stessi, con l'aggiunta di un inibitore ROCK.
3. Preparare il terreno base organoide combinando 500 ml di una formulazione avanzata di DMEM/F12 con 1% di penicillina-streptomicina, 1x dipeptide, L-alanil-L-glutammina e 1x HEPES (10 mM) (vedere Tabella dei materiali).

2. Raccolta di organoidi da ascite e liquido pleurico

NOTA: L'ascite e il liquido pleurico devono essere trattati il prima possibile per la migliore resa degli organoidi. Scongelare precedentemente il tampone di reazione BME, DNasi I e DNasi I (vedi Tabella dei materiali) mettendolo su ghiaccio fino a quando il contenuto non è liquefatto.

1. Ottenere ascite e liquido pleurico da pazienti consenzienti al momento di interventi chirurgici o procedure di cura standard e trasportare a temperatura ambiente in un contenitore da viaggio al laboratorio.
   NOTA: Tutta la lavorazione dell'ascite o del liquido pleurico deve essere eseguita in ambiente sterile.
2. Trasferire 50 ml di ascite o liquido pleurico in tubi conici da 50 ml (il numero di tubi dipende dal volume di ascite ottenuto). Centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta Pasteur di vetro per aspirare con cura il surnatante.
3. Continuare aggiungendo 50 ml di ascite o liquido pleurico al pellet precedentemente centrifugato e centrifugare nuovamente a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare con cura il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro. Ripetere questo passaggio fino a quando tutta l'ascite o il liquido pleurico sono stati elaborati.
4. Preparare una soluzione di DNasi I da 100 μg/mL combinando 1.000 μL di acqua priva di nucleasi, 100 μL di tampone di reazione DNasi I e 10 μL di DNasi I.
   NOTA: Il trattamento con DNasi I applicato è sufficiente per effettuare una sospensione unicellulare indipendentemente dalla presenza di aggregati cellulari in alcuni campioni di pazienti¹².
5. Risospendere ogni pellet cellulare in 1 mL di soluzione di 100 μg/mL di DNasi I. Aggiungere delicatamente la soluzione di DNasi I a goccia e lasciare incubare il tubo per 15 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Aggiungere almeno 1 mL di soluzione di DNasi I. Se 1 mL non è sufficiente per disturbare il pellet, aggiungere un altro 1 mL.
6. Dopo l'incubazione, aggiungere 25 ml di terreno base organoide (fase 1.3) alle cellule e invertire delicatamente per mescolare. Quindi, centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro.
7. Risospendere i pellet cellulari appena formati in 5 ml preriscaldati di 1x tampone di lisi dei globuli rossi (RBC) (vedere Tabella dei materiali). Impostare il vortice su 458 x g e vortice le soluzioni in ciascun tubo conico. Una volta che le soluzioni sono omogenee, utilizzare un pipetta sierologica per combinare il contenuto di tutti i tubi conici in un unico tubo conico da 50 ml.
8. Incubare il tubo conico contenente la soluzione vortexata a temperatura ambiente per 5 min. Una volta completata l'incubazione, centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C.
   NOTA: Esaminare il pellet. Un pellet rosa/rosso indica la presenza di globuli rossi, che richiederebbe la ripetizione della fase tampone di lisi dei globuli rossi fino a quando il pellet non è più rosso.
9. Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro. Quindi, lavare il pellet con 10 ml di PBS, vortice la soluzione a 458 x g e centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C.
10. Se si forma un pellet a cellule grandi, aspirare il PBS usando una pipetta Pasteur di vetro e aggiungere 1 mL di base organoide (fase 1.3) sopra il pellet. Vortice la soluzione a 458 x g e trasferire 300-400 μL in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare il tubo della microcentrifuga a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C.
    NOTA: La porzione di pellet cellulare non inserita nel tubo della microcentrifuga può essere congelata per un uso futuro (500 μL di cellule a 1 mL di DMSO al 10% in FBS). Il pellet cellulare congelato può essere conservato per settimane a -80 °C e per anni se posto in azoto liquido¹³.
11. Aspirare con cautela il mezzo base organoide (punto 1.3) utilizzando una pipetta Pasteur in vetro e risospendere in BME (vedere Tabella dei materiali) utilizzando punte fredde.
    NOTA: La quantità di BME si basa sulla dimensione del pellet. Si raccomanda di utilizzare il 25% di terreno base organoide (fase 1.3) con cellule risospese al 75% di BME.
12. Piastra 40 μL aliquote della soluzione di cella risospesa su una piastra a 6 pozzetti. Placcare fino a cinque aliquote per pozzetto (Figura 1).
13. Posizionare immediatamente la piastra in un incubatore a 37 °C per 20 minuti per consentire al BME di solidificarsi. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 2 ml di mezzo organoide completo (fase 1.2) in ciascun pozzetto.

Figura 1: Placcatura di organoidi di cancro ovarico derivati da pazienti. Immagine rappresentativa della placcatura organoide. Le aliquote della miscela organoide sono accuratamente placcate, assicurando che non si formino bolle. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

3. Raccolta di organoidi dal tessuto

NOTA: Il tessuto deve essere lavorato il prima possibile per la migliore resa di organoidi.

1. Raccogliere e trasportare il tumore sul ghiaccio in un contenitore da viaggio contenente PBS.
2. Porre il campione su una capsula di coltura di tessuto di 10 cm (Figura 2). Usando un bisturi usa e getta, tritare il tessuto. Quindi, utilizzando l'estremità opaca di una siringa monouso, schiacciare il tessuto fino a creare una miscela omogenea.
3. Usando una pinza, posizionare la miscela di tessuto omogeneo in un tubo di dissociazione. Per ogni 1-2 mL di tessuto omogeneizzato, aggiungere 7-8 mL di soluzione di collagenasi di tipo II 1 mg/mL (vedere Tabella dei materiali) in mezzo base organoide (fase 1.3) e 1 mL di soluzione di DNasi I. Vortice la soluzione a 458 x g.
   NOTA: La quantità di tessuto determinerà la quantità di soluzione di collagenasi e il numero di tubi necessari.
4. Utilizzare la macchina di dissociazione (vedere Tabella dei materiali) per liquefare il tessuto mentre si trova nella soluzione di collagenasi. Eseguire il programma 37C_h_TDK3 (1 ora) fino a quando non è una sospensione a cella singola.
   NOTA: il programma dovrà essere rieseguito se la miscela risultante non è omogenea (cioè se nella miscela sono ancora presenti pezzi di tessuto). Se il tessuto è digerito ma la soluzione è viscosa, diluire con un mezzo base organoide (punto 1.3).
5. Trasferire la miscela omogeneizzata in un nuovo tubo conico da 50 mL e aggiungere 20-40 mL di terreno base organoide (fase 1.3). Quindi, filtrare la soluzione attraverso un filtro cellulare da 100 μm in un tubo conico da 50 ml appena etichettato.
6. Centrifugare la miscela filtrata a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Quindi, aspirare con cura il surnatante usando una pipetta Pasteur di vetro.
7. Preparare una soluzione di DNasi I da 100 μg/mL combinando 1.000 μL di acqua priva di nucleasi, 100 μL di tampone di reazione DNasi I e 10 μL di DNasi I.
   NOTA: Il trattamento con DNasi I applicato è sufficiente per effettuare una sospensione unicellulare indipendentemente dalla presenza di aggregati cellulari in alcuni campioni di pazienti¹².
8. Risospendere le cellule in 1 mL di soluzione di 100 ug/mL DNasi I. Aggiungere delicatamente la soluzione di DNasi I a goccia e lasciare incubare il tubo per 15 minuti a temperatura ambiente.
9. Dopo l'incubazione, aggiungere 25 ml di terreno base organoide (fase 1.3) alle cellule e invertire delicatamente per mescolare. Quindi, centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro.
10. Risospendere il pellet cellulare appena formato in 5 ml di tampone di lisi 1x RBC preriscaldato. Vortice le soluzioni in ciascun tubo conico a 458 x g.
11. Incubare il tubo conico contenente il pellet cellulare risospeso nel tampone di lisi dei globuli rossi per 5 minuti. Una volta completata l'incubazione, centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C.
    NOTA: Esaminare il pellet. Un pellet rosa/rosso indica la presenza di globuli rossi, che richiederebbe la ripetizione della fase del tampone di lisi dei globuli rossi fino a quando il pellet appare bianco.
12. Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro. Quindi, lavare il pellet con 10 ml di PBS, vortice la soluzione a 458 x g e centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C.
13. Se si forma un pellet a cellule grandi, aspirare il PBS usando una pipetta Pasteur di vetro e aggiungere 1 mL di base organoide (fase 1.3) sopra il pellet. Vortice la soluzione a 458 x g e trasferire 300-400 μL in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C.
    NOTA: La porzione di pellet cellulare non inserita nel tubo della microcentrifuga può essere congelata per un uso futuro (500 μL di cellule a 1 mL di DMSO al 10% in FBS) (fase 5.1). Il pellet cellulare congelato può essere conservato per settimane a -80 °C e per anni se posto in azoto liquido¹³.
14. Aspirare con cura il mezzo base organoide utilizzando una pipetta Pasteur di vetro e risospendere in BME utilizzando punte fredde.
    NOTA: La quantità di BME si basa sulla dimensione del pellet. Si raccomanda di aggiungere il 25% di terreno base organoide (fase 1.3) con cellule risospese al 75% di BME.
15. Placcare la soluzione cellulare risospesa su una piastra a 6 pozzetti in aliquote da 40 μL. Impiattare fino a cinque aliquote per pozzetto.
16. Posizionare immediatamente la piastra del pozzetto nell'incubatore per 20 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 2 ml di mezzo organoide completo (fase 1.2) in ciascun pozzetto.

Figura 2: Tessuto tumorale prima della dissezione. Immagine rappresentativa del tessuto tumorale ottenuto per la generazione di organoidi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Passaggio degli organoidi

NOTA: Se il campione è confluente, ogni pozzetto organoide può essere fatto passare settimanalmente in due nuovi pozzi.

1. Utilizzando una pipetta da 1 mL, aggiungere 1 mL di terreno base organoide (punto 1.3) a ciascun pozzetto e pipettare il fluido su e giù direttamente sulle linguette organoidi per dissociarlo. Raccogliere tutto il mezzo contenente i pellet risospesi in un tubo conico da 15 ml.
2. Centrifugare il tubo conico da 15 mL contenente la miscela a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Quindi, aspirare con cura il surnatante usando una pipetta Pasteur di vetro.
3. Aggiungere 1 mL di enzima ricombinante privo di origine animale (vedi Tabella dei materiali) al pellet cellulare, vortice la soluzione a 458 x g e trasferire in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Lasciare incubare il tubo per 15 minuti a bagnomaria a 37 °C.
4. Dopo l'incubazione, centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Quindi, aspirare con cura il surnatante usando una pipetta Pasteur di vetro.
5. Risospendere il pellet in BME.
   NOTA: La quantità di BME si basa sulla dimensione del pellet. Si raccomanda di aggiungere il 25% di media base organoidi (fase 1.3) con cellule risospese al 75% di BME.
6. Placcare la soluzione di cella risospesa in una piastra a 6 pozzetti in aliquote da 40 μL. Impiattare fino a cinque aliquote per pozzetto. Una volta che tutte le aliquote sono state placcate, posizionare immediatamente la piastra del pozzetto nell'incubatrice per 20 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 2 ml di mezzo organoide completo (fase 1.2) in ciascun pozzetto.

5. Congelamento e scongelamento degli organoidi

1. Congelamento di organoidi
   1. Iniziare con i passaggi 4.1-4.4.
   2. Risospendere il pellet cellulare in 0,5-1 mL di terreno di congelamento della coltura cellulare di recupero (vedere Tabella dei materiali) e trasferire 1 mL a ciascun crioviale.
   3. Quindi, posizionare i crioviali in un contenitore riempito di isopropanolo a -80 °C per un massimo di 2 settimane prima di trasferirli in un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine¹³.
2. Scongelamento degli organoidi
   1. Prelevare i campioni dal serbatoio di azoto liquido e scongelarli a bagnomaria a 37 °C.
   2. Una volta scongelato, trasferire in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro.
   3. Risospendere il pellet in BME.
      NOTA: La quantità di BME si basa sulla dimensione del pellet. Si raccomanda di aggiungere il 25% di media base organoidi (fase 1.3) con cellule risospese al 75% di BME.
   4. Placcare la soluzione cellulare risospesa su una piastra a 6 pozzetti in aliquote da 40 μL. Posizionare fino a cinque aliquote per pozzetto.
   5. Posizionare immediatamente la piastra nell'incubatore per 20 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 2 ml di mezzo organoide completo (fase 1.2) ai pozzetti.

6. Incorporamento e generazione di vetrini incorporati in paraffina fissati in formalina (FFPE) per valutare la composizione organoide

1. Dopo aver coltivato gli organoidi per almeno 10 giorni per garantire dimensioni adeguate, rimuovere l'intero mezzo organoide dai pozzetti e aggiungere 1 ml di fissativo paraformaldeide al 2% (PFA). Incubare a temperatura ambiente per 5-10 min.
2. Dopo l'incubazione, lavare le aliquote organoidi coltivate 3 volte per 5 minuti ogni volta con 1 mL di PBS.
3. Rimuovere il PBS da ciascun pozzetto e aggiungere 1 ml di agar caldo al 2% in H₂O deionizzato a ciascun pozzetto. Quando si aggiunge l'agar, sollevare le aliquote organoidi coltivate dal piatto usando una spatola.
   NOTA: È importante non lasciare che l'agar si indurisca prima di sollevare le aliquote organoidi coltivate.
   1. Lasciare che l'agar si solidifichi nel pozzetto a temperatura ambiente.
4. Utilizzando una piccola spatola, liberare l'agar solidificato dal pozzetto e conservarlo in una cassetta per un massimo di 48 ore (vedi Tabella dei materiali) a 4 °C in etanolo al 70% fino alla lavorazione¹⁴.
5. Incorporare i campioni nella paraffina 15, tagliare i vetrini a uno spessore di 5 μm e colorare i vetrini con la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E, vedi Tabella dei materiali) utilizzando un protocollo standard¹⁵.

Risultati

Per generare PDO, i campioni sono stati digeriti meccanicamente ed enzimaticamente in sospensioni monocellulari. Le cellule sono state quindi risospese in BME e integrate con mezzi specificamente ingegnerizzati (Figura 3). Gli organoidi sono tipicamente stabiliti in un arco di tempo di 10 giorni, dopo di che dimostrano organoidi discreti in coltura (Figura 4).

Discussione

Il cancro ovarico è estremamente mortale a causa del suo stadio avanzato alla diagnosi, così come lo sviluppo comune della resistenza alla chemioterapia. Molti progressi nella ricerca sul cancro ovarico sono stati fatti utilizzando linee cellulari tumorali e modelli PDX; Tuttavia, vi è un'evidente necessità di un modello in vitro più rappresentativo e conveniente. Le PDO hanno dimostrato di rappresentare accuratamente l'eterogeneità del tumore, il microambiente tumorale e le caratteristiche genomiche e tra...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% HEPES	Life Technologies	15630080
1% Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	30002CI
1.5 mL Eppendorf Tubes	Genesee Scientific	14125
10 cm Tissue Culture Dish	TPP	93100
10 mL Serological Pipet
100 µm Cell Filter	MidSci	100ICS
15 mL centrifuge tubes	Corning	430052
2 mL Cryovial	Simport Scientific	T301-2
2% Paraformaldehyde Fixative	Sigma-Aldrich
37 °C water bath	NEST	602052
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement	Millipore Sigma	SCM104
6 well plates	TPP	92006
70% Ethanol	Sigma-Aldrich	R31541GA
A83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher	12634028
Agar	Lamda Biotech	C121
B-27	Life Technologies	17504044
Centrifuge
Cultrex Type 2	R&D Systems	3533-010-02	basement membrane extract
DNase I	New England Bio Labs	M0303S
DNase I Reaction Buffer	New England Bio Labs	M0303S
EGF	PeproTech	AF-100-15
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
FGF-10	PeproTech	100-26
FGF2	PeproTech	100-18B
gentleMACS C Tubes	Miltenyi BioTech	130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi BioTech	130-096-427	We use the manufacturers protocol.
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	dipeptide, L-alanyl-L-glutamine
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Fisher Scientific	NC1470670
Histoplast Paraffin Wax	Fisher Scientific	22900700
Microcentrifuge
Mr. Frosty Freezing Container	Fisher Scientific	07202363S
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
p1000 Pipette with Tips
p200 Pipette with Tips
Pasteur Pipettes 9"	Fisher Scientific	1367820D
PBS	Fisher Scientific	MT21031CM
Pipet Controller
Prostaglandin E2	R&D Systems	2296
Puromycin	ThermoFisher	A1113802
Recombinant Murine Noggin	PeproTech	250-38
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Invitrogen	12648010
Red Blood Cell Lysis Buffer	BioLegend	420301
ROCK Inhibitor (Y-27632)	R&D Systems	1254/1
SB202190	Sigma-Aldrich	S7076
T75 Flask	MidSci	TP90076
Tissue Culture Hood
Tissue Embedding Cassette
TrypLE Express	Invitrogen	12604013	animal origin-free, recombinant enzyme
Type II Collagenase	Life Technologies	17101015
Vortex