Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Cancer Research
Patient-derived organoids (PDO) är en tredimensionell (3D) kultur som kan efterlikna tumörmiljön in vitro. Vid höggradig serös äggstockscancer utgör SUB en modell för att studera nya biomarkörer och terapier.
Organoider är 3D-dynamiska tumörmodeller som kan odlas framgångsrikt från patient-härledd äggstockstumörvävnad, ascites eller pleuravätska och hjälper till vid upptäckten av nya terapier och prediktiva biomarkörer för äggstockscancer. Dessa modeller rekapitulerar klonal heterogenitet, tumörmikromiljön och cell-cell- och cell-matrisinteraktioner. Dessutom har de visat sig matcha den primära tumören morfologiskt, cytologiskt, immunhistokemiskt och genetiskt. Således underlättar organoider forskning om tumörceller och tumörmikromiljön och är överlägsna cellinjer. Det nuvarande protokollet beskriver distinkta metoder för att generera patient-härledda äggstockscancerorganoider från patienttumörer, ascites och pleuravätskeprover med en högre än 97% framgångsgrad. Patientproverna separeras i cellulära suspensioner genom både mekanisk och enzymatisk nedbrytning. Cellerna pläteras sedan med hjälp av ett basalmembranextrakt (BME) och stöds med optimerade tillväxtmedier som innehåller kosttillskott som är specifika för odling av höggradig serös äggstockscancer (HGSOC). Efter att ha bildat initiala organoider kan SUB: erna upprätthålla långsiktig kultur, inklusive passaging för expansion för efterföljande experiment.
År 2021 diagnostiserades cirka 21 410 kvinnor i USA nyligen med epitelial äggstockscancer och 12 940 kvinnor dog av denna sjukdom1. Även om tillräckliga framsteg har gjorts inom kirurgi och kemoterapi, utvecklar över 70% av patienterna med avancerad sjukdom kemoterapeutisk resistens och dör inom 5 år efter diagnos 2,3. Därför behövs nya strategier för att behandla denna dödliga sjukdom och representativa, tillförlitliga modeller för preklinisk forskning.
Cancercellinjer och patient-derived xenografts (PDX) skapade från primära äggstockstumörer är de viktigast....
Alla mänskliga vävnadsprover som samlats in för forskning erhölls enligt det protokoll som godkänts av Institutional Review Board (IRB). Protokollen som beskrivs nedan utfördes i en steril human vävnadsodlingsmiljö. Informerat skriftligt samtycke erhölls från människor. Berättigade patienter måste ha en diagnos eller förmodad diagnos av äggstockscancer, vara villiga och kunna underteckna informerat samtycke och vara minst 18 år. Tumörvävnad (malign primärtumör eller metastatiska platser), ascites och .......
För att generera SUB röts proverna mekaniskt och enzymatiskt till encellssuspensioner. Cellerna återsuspenderades sedan i BME och kompletterades med specifikt konstruerade medier (figur 3). Organoider etableras typiskt under en tidsram på 10 dagar, varefter de visar diskreta organoider i kultur (figur 4).
Äggstockscancer är extremt dödlig på grund av dess avancerade stadium vid diagnos, liksom den vanliga utvecklingen av kemoterapiresistens. Många framsteg inom äggstockscancerforskning har gjorts genom att använda cancercellinjer och PDX-modeller; Det finns dock ett uppenbart behov av en mer representativ och överkomlig in vitro-modell . SUBs har visat sig exakt representera tumörheterogeniteten, tumörmikromiljön och de genomiska och transkriptomiska egenskaperna hos deras primära tumörer och är dä.......
Vi är tacksamma för vägledningen från Ron Bose, MD, PhD, och hjälpen från Barbara Blachut, MD, vid upprättandet av detta protokoll. Vi vill också erkänna Washington University's School of Medicine i St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology och Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program och Reproductive Scientist Development Program för deras stöd till detta projekt.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
10 mL Serological Pipet | |||
100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
37 °C water bath | NEST | 602052 | |
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
Agar | Lamda Biotech | C121 | |
B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
Centrifuge | |||
Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
Microcentrifuge | |||
Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
p1000 Pipette with Tips | |||
p200 Pipette with Tips | |||
Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
Pipet Controller | |||
Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
Tissue Culture Hood | |||
Tissue Embedding Cassette | |||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
Vortex |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved