Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Cancer Research
Hasta kaynaklı organoidler (PDO), tümör ortamını in vitro olarak taklit edebilen üç boyutlu (3D) bir kültürdür. Yüksek dereceli seröz over kanserinde, PDO'lar yeni biyobelirteçleri ve terapötikleri incelemek için bir model oluşturur.
Organoidler, hasta kaynaklı yumurtalık tümör dokusundan, asitlerinden veya plevral sıvıdan başarıyla yetiştirilebilen ve yumurtalık kanseri için yeni terapötiklerin ve prediktif biyobelirteçlerin keşfine yardımcı olan 3D dinamik tümör modelleridir. Bu modeller klonal heterojenliği, tümör mikroçevresini ve hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini özetler. Ek olarak, primer tümörü morfolojik, sitolojik, immünohistokimyasal ve genetik olarak eşleştirdikleri gösterilmiştir. Böylece, organoidler tümör hücreleri ve tümör mikroçevresi üzerinde araştırmayı kolaylaştırır ve hücre hatlarından üstündür. Mevcut protokol, %97'den daha yüksek başarı oranına sahip hasta tümörleri, asitler ve plevral sıvı örneklerinden hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidleri üretmek için farklı yöntemler tanımlamaktadır. Hasta örnekleri hem mekanik hem de enzimatik sindirim ile hücresel süspansiyonlara ayrılır. Hücreler daha sonra bir bazal membran ekstresi (BME) kullanılarak kaplanır ve yüksek dereceli seröz yumurtalık kanserinin (HGSOC) kültürlenmesine özgü takviyeler içeren optimize edilmiş büyüme ortamı ile desteklenir. İlk organoidleri oluşturduktan sonra, PDO'lar sonraki deneyler için genişleme için pasaj da dahil olmak üzere uzun vadeli kültürü sürdürebilir.
2021 yılında, Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 21.410 kadına yeni epitel yumurtalık kanseri teşhisi kondu ve 12.940 kadın bu hastalıktan öldü1. Cerrahi ve kemoterapide yeterli ilerlemeler kaydedilmesine rağmen, ilerlemiş hastalığı olan hastaların %70'inden fazlası kemoterapötik direnç geliştirir ve tanıdan sonraki 5 yıl içinde ölür 2,3. Bu nedenle, bu ölümcül hastalığı tedavi etmek için yeni stratejilere ve klinik öncesi araştırmalar için temsili, güvenilir modellere acilen ihtiyaç duyulmaktadır.
Kanser hücre hatları ve primer over tümörlerinden oluşt....
Araştırma için toplanan tüm insan dokusu örnekleri, Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylı protokole göre elde edilmiştir. Aşağıda özetlenen protokoller steril bir insan doku kültürü ortamında gerçekleştirilmiştir. İnsan deneklerden bilgilendirilmiş yazılı onam alındı. Uygun hastaların yumurtalık kanseri tanısı veya varsayılan tanısı olması, bilgilendirilmiş onam imzalamaya istekli ve yetenekli olması ve en az 18 yaşında olması gerekiyordu. Tümör dokusu (malign primer tümör veya .......
PDO'lar üretmek için, numuneler mekanik ve enzimatik olarak tek hücreli süspansiyonlara sindirildi. Hücreler daha sonra BME'de yeniden askıya alındı ve özel olarak tasarlanmış ortamlarla desteklendi (Şekil 3). Organoidler tipik olarak 10 günlük bir zaman diliminde kurulur, daha sonra kültürde ayrı organoidler gösterirler (Şekil 4).
Yumurtalık kanseri, tanıdaki ileri aşaması ve kemoterapi direncinin ortak gelişimi nedeniyle son derece ölümcüldür. Yumurtalık kanseri araştırmalarında kanser hücre hatları ve PDX modelleri kullanılarak birçok ilerleme kaydedilmiştir; Bununla birlikte, daha temsili ve uygun fiyatlı bir in vitro modele belirgin bir ihtiyaç vardır. PDO'ların tümör heterojenliğini, tümör mikroçevresini ve primer tümörlerinin genomik ve transkriptomik özelliklerini doğru bir şekilde temsil ettiği ka.......
Ron Bose, MD, PhD'nin rehberliği ve bu protokolün oluşturulmasında Barbara Blachut, MD'nin yardımı için minnettarız. Ayrıca, St. Louis'in Kadın Hastalıkları ve Doğum Bölümü ve Jinekolojik Onkoloji Bölümü'ndeki Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne, Washington Üniversitesi Dekan'ın Akademik Programı'na ve Üreme Bilim İnsanı Geliştirme Programı'na bu projeye verdikleri destek için teşekkür ederiz.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
10 mL Serological Pipet | |||
100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
37 °C water bath | NEST | 602052 | |
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
Agar | Lamda Biotech | C121 | |
B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
Centrifuge | |||
Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
Microcentrifuge | |||
Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
p1000 Pipette with Tips | |||
p200 Pipette with Tips | |||
Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
Pipet Controller | |||
Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
Tissue Culture Hood | |||
Tissue Embedding Cassette | |||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
Vortex |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved