Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
מוצגת כאן טכניקה מבוססת ציטומטריית זרימה המאפשרת למדוד בו זמנית את מספר חלוקות התא, פנוטיפ תאי פני השטח וקרבה תאית. ניתן לבדוק תכונות אלה באופן סטטיסטי באמצעות מסגרת מבוססת תמורות.
טכניקות מעטות יכולות להעריך פנוטיפ וגורל עבור אותו תא בו זמנית. רוב הפרוטוקולים הנוכחיים המשמשים לאפיון פנוטיפ, למרות שהם מסוגלים ליצור מערכי נתונים גדולים, מחייבים את הרס התא המעניין, מה שהופך אותו לבלתי אפשרי להעריך את גורלו התפקודי . לכן קשה לתאר מערכות התמיינות ביולוגיות הטרוגניות כמו המטופויזה. בהתבסס על צבעי מעקב אחר חלוקת תאים, פיתחנו פרוטוקול לקביעת קרבה, מספר חלוקה ומצב התמיינות בו זמנית עבור אבות המטופויטיים בודדים רבים. פרוטוקול זה מאפשר להעריך את פוטנציאל התמיינות ex vivo של אבות המטופויטיים מורינים ובני אדם, מבודדים ממקורות ביולוגיים שונים. יתר על כן, מכיוון שהוא מבוסס על ציטומטריית זרימה ומספר מוגבל של ריאגנטים, הוא יכול לייצר במהירות כמות גדולה של נתונים, ברמת התא הבודד, באופן זול יחסית. אנו מספקים גם את הצינור האנליטי לניתוח תא יחיד, בשילוב עם מסגרת סטטיסטית חזקה. מכיוון שפרוטוקול זה מאפשר קישור של חלוקת תאים והתמיינות ברמת התא הבודד, ניתן להשתמש בו כדי להעריך כמותית מחויבות גורל סימטרית וא-סימטרית, את האיזון בין התחדשות עצמית להתמיינות, ואת מספר החלוקות עבור גורל מחויבות נתון. בסך הכל, פרוטוקול זה יכול לשמש בתכנונים ניסיוניים שמטרתם לפענח את ההבדלים הביולוגיים בין אבות המטופויטיים, מנקודת מבט של תא יחיד.
העשור האחרון עמד בסימן התפשטות עולמית של גישות חד-תאיות לביולוגיה תאית ומולקולרית. בעקבות השלבים של גנומיקה של תא בודד1,2, כיום ניתן לחקור מרכיבים רבים של תא בודד (למשל, DNA, RNA, חלבונים), עם טכניקות חדשניות של תא בודד -omics המתפתחות מדי שנה. טכניקות אלה שפכו אור על שאלות ישנות וחדשות בתחומי האימונולוגיה, נוירוביולוגיה, אונקולוגיה ועוד, הן באמצעות תאי אורגניזם אנושיים והן באמצעות תאי אורגניזם מודל3. על ידי הדגשת ההבדלים בין תאים בודדים, תא בודד -omics הניע את ההגדרה של מודל חדש של hematopoiesis, שבמרכזו ההטרוגניות של תאי גזע ותאי אב hematopoietic (HSPCs) והתרחקות מהמודל הקלאסי של אוכלוסיות הומוגניות בדידות 4,5.
אחד החסרונות המעטים של כל טכניקות -omics הוא הרס התא של עניין, מניעת האפשרות להעריך את הפונקציונליות שלה. לעומת זאת, שיטות חד-תאיות אחרות, כגון בדיקת השתלה של תא בודד וטכנולוגיות למעקב אחר שושלת, מספקות קריאה של הפונקציונליות של תא האב הקדמון על ידי הערכת גורלם של תאים בודדים in vivo 6,7. טכנולוגיות מעקב אחר שושלת כוללות תיוג התא המעניין עם גנטיקה תורשתית7 או תווית פלואורסצנטית8,9, מה שמאפשר לעקוב אחר גורלם של תאים בודדים מרובים בו זמנית. עם זאת, אפיון התאים ההתחלתיים מוגבל בדרך כלל למספר מוגבל של פרמטרים, כגון ביטוי של כמה חלבוני שטח המוערכים על ידי ציטומטריית זרימה10. בנוסף, טכנולוגיות מעקב אחר שושלת חד-תאית דורשות זיהוי מייגע של התווית התאית, בדרך כלל באמצעות ריצוף DNA/RNA או הדמיה. נקודה אחרונה זו מגבילה במיוחד את מספר התנאים שניתן לבחון בניסוי יחיד.
סוג נוסף של שיטות המשמשות לחקר הפונקציונליות של תאים בודדים הן מערכות תרבית תאים ex vivo של HSPCs בודדים. קל לבצע, בדיקות תקן זהב אלה כוללות מיון של תאים בודדים לתוך 96-בארות כלי תרבית התא, ולאחר תרבית, אפיון פנוטיפ צאצאי התא, בדרך כלל על ידי ציטומטריה זרימה או ניתוח מורפולוגי. בדיקות אלה שימשו בעיקר כדי לאפיין את ההתמיינות ארוכת הטווח של HSPCs לתאים בוגרים, בדרך כלל לאחר 2-3 שבועות של תרבית11,12. לחלופין, הם שימשו כדי לנסות לשמר ולהרחיב את Ex vivo HSPCs 13,14,15,16,17,18, עם הבטחה לתועלת רפואית להשתלת תאי גזע אנושיים 19. לבסוף, הם שימשו לחקר המחויבות המוקדמת של HSPCs באמצעות תרבית לטווח קצר20, כאשר המספר הנמוך של תאים שנוצרו בתרבית זו הוא הגורם המגביל העיקרי. חסרון אחד של סוגים שונים אלה של מבחני ex vivo הוא שהם משקפים רק באופן חלקי את מורכבות in vivo; ובכל זאת, הם אחת הדרכים הנדירות לחקור התמיינות HSPC אנושית.
פיסת מידע אחת חסרה משיטות קיימות של תא בודד (אומיקה של תא בודד, מעקב אחר שושלת ותרבית ex vivo) היא זיהוי מדויק של חלוקות תאים, פרמטר חיוני שיש לקחת בחשבון כאשר חוקרים דינמיקה של HSPC21. דרך פשוטה להעריך את מספר החלוקות באמצעות ציטומטריית זרימה היא שימוש ב"צבעי חלבון" מסיסים, כמו 5-(ו-6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)22. צבעי חלוקה אלה מתפזרים בתוך הציטופלסמה של התאים המוכתמים, מדוללים בחצי ומועברים לשני תאי הבת בכל חלוקת תא, מה שמאפשר למנות עד 10 חלוקות. שילוב של מספר צבעי חלוקה, ניתן לזרוע מספר אבות בודדים באותה באר, שכן כל צבע בודד מאפשר הפרדה בין הצאצאים השונים. זהו העיקרון מאחורי השימוש בצבעי תאים למעקב אחר שיבוט וחלוקה מרובה שהוצג לראשונה עבור לימפוציטים מורינים23,24.
כאן, אנו מציגים את הפיתוח של בדיקת MultiGen לשימוש עם HSPCs מורין ובני אדם. הוא מאפשר בדיקה של תאים בודדים רבים בו זמנית עבור תכונות ההתמיינות, החלוקה והקרבה שלהם ex vivo. בדיקה זו, בעלת תפוקה גבוהה, קלה לביצוע וזולה זו מאפשרת למדוד את הפנוטיפ התאי, את מספר החלוקות שבוצעו, ואת קרבת התאים ויחסי השבט עם התאים האחרים בבאר, והכל בו זמנית. ניתן להשתמש בו כדי להעריך כמותית מחויבות גורל סימטרית וא-סימטרית, את האיזון בין התחדשות עצמית לבין דיפרנציאציה, ואת מספר החלוקות הדרושות לגורל מחויבות נתון. הפרוטוקול דורש ממיין תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) וציטומטר זרימה עם קורא לוחות, בתוספת הציוד הדרוש לביצוע תרבית תאים. בנוסף לפרוטוקול הטכני לביצוע הבדיקה על HSPCs אנושיים, אנו מספקים גם את מסגרת הניתוח המפורטת, כולל הבדיקות הסטטיסטיות הדרושות להערכת תכונות תאיות הקשורות למושג משפחת תאים25. פרוטוקול זה כבר שימש בהצלחה לתיאור תא HSPC מורין26,27.
הפרוטוקול הבא משתמש בתאי CD34+ מועשרים מגנטית כחומר המוצא28. בדרך זו, ניתן להכתים ולבודד ביעילות את HSPCs האנושיים ממקורות דם שונים (למשל, דם טבורי, מח עצם, דם היקפי). חשוב לא להשליך את שבר CD34, מכיוון שהוא ישמש כחלק מהפרוטוקול להגדרת סוגים שונים של בקרות ניסיוניות. ניתן להגדיל או להקטין את כמויות התאים והנפחים שהוזכרו, בהתאם לזרימת העבודה הניסיונית ולצרכים. באופן דומה, ניתן להתאים את הפרוטוקול לחקר סוגים שונים של אבות, פשוט על ידי שינוי הנוגדנים המשמשים למיון התאים ולשלבי ציטומטריית הזרימה.
עבור הפרוטוקול הבא, דם טבורי ללא זיהוי שימש כמקור HSPC ונאסף בהתאם להנחיות שהוגדרו על ידי ביובנק הדם הטבורי של בית החולים סנט לואי (אישור AC-2016-2759) ועם הצהרת הלסינקי.
הערה: לפני שתתחיל, ודא שכל הריאגנטים והציוד הדרושים לפרוטוקול זה זמינים, כמפורט בטבלת החומרים ומוזכר בפרוטוקול. הכינו את הריאגנטים הרלוונטיים טריים ואל תאחסנו אותם, אלא אם צוין זאת במפורש.
1. צביעת צבע התא
הערה: סעיף זה מתאר צביעה עם ארבעה שילובים של צבעי חלוקת תאים CFSE וצבע סגול (CTV). מעבדים את כל הצינורות בו זמנית, גם אם לא מוסיפים תמיסת צבע לתאים. כל השלבים מבוצעים בתנאים סטריליים כדי לאפשר את שלב תרבית התאים הבא. הזמן הנדרש: כ-100 דקות.
2. צביעת נוגדנים
הערה: ניתן להתאים את צביעת הנוגדנים בהתאם לצרכי הניסוי. רק שברי CD34+ עוברים צביעת נוגדנים; שברי CD34 משמשים כבקרת צביעה יחידה עבור שילובי הצבעים של חלוקת התא (שברים CV, VC, CF ו- VI). הפאנל הבא מותאם לזיהוי ארבעה סוגים של HSPCs: תאי גזע המטופויטיים (HSC), אבות רב-פוטנטיים (MPPs), אבות רב-פוטנטיים ראשוניים לימפואידים (LMPPs) ותאי אב המטופויטיים (HPC)12. עם זאת, זיהוי של HSCs ו- MPPs מוצג. הזמן הנדרש: 75 דקות.
טבלה 1: תבנית להכנת תערובת האב של הנוגדנים לניסוי מיון תאים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
3. מיון תאים
הערה: מספרי התאים הממוינים עשויים להשתנות בהתאם לכמות התאים הכוללת הזמינה. בפרוטוקול, מסופק מספר תא מינימלי עבור כל פקד. הזמן הדרוש (לצלחת בודדת): 100 דקות.
טבלה 2: תבנית עבור לוח תא הממיין 96 בארות, בהתבסס על הדרישות הספציפיות לניתוח ציטומטריית זרימה עוקבת. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
4. ניתוח נתוני מיון תאים
הערה: כדי לאמת את איכות מיון התאים, ניתוח נתוני FACS נחוץ לפני שמתקדמים הלאה. הפלט העיקרי של שלב זה הוא יצירת גיליון אלקטרוני המכיל את עוצמות הסמן של כל תא בודד ממוין.
5. לאחר הכתמת נוגדנים בתרבית
הערה: בצע חלק זה של הפרוטוקול בתנאים סטריליים; מספר ריאגנטים משותפים עם השלבים הראשונים, וצריכים להישאר סטריליים. לניתוח ציטומטריית זרימה, השתמש בציטומטר זרימה עם קורא לוחות. זה מאפשר לבצע את הצביעה ישירות בצלחת תרבית הרקמה, הפחתת אובדן התא למינימום על ידי הגבלת כמות הצנרת והספינינג. הכינו את צביעת סמן המשטח בצבע יחיד באמצעות חרוזי הפיצוי, למעט בארות A1-A4, המייצגות את הצביעה היחידה לצבעי CF/CV/VC/VI וכבר קיימות בלוח 96 הקידוחים. אוכלוסיות הצובר הממוינות על פי צבע התא עוזרות לקבוע את אסטרטגיית הגאטינג למספר החטיבות ולגידור הכללי. זמן נדרש: 120 דקות.
טבלה 3: תערובת מופת של נוגדנים לניסוי ציטומטריית זרימה, במיוחד לזיהוי HSPCs מדם טבורי אנושי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
6. ניתוח נתוני ציטומטריה של זרימה לאחר תרבית
הערה: ניתוח הנתונים המתואר הוא ספציפי עבור התוכנה המוזכרת בטבלת החומרים. הפלט העיקרי הוא יצירת גיליון אלקטרוני המכיל מידע על עוצמת סמן פני השטח, מספר החלוקות וקרבה לכל תא מנותח. חלק זה של הפרוטוקול כלול סקריפט שנכתב ב-R, הדרוש לזרימת עבודה זו כדי ליצור את גיליון הניתוח הסופי.
טבלה 4: מטריצת גטינג להקצאת גורל התא, לפני הניתוח הסטטיסטי. CD45h מתייחס לעוצמה של CD45RA עבור תת-קבוצה של HPC, בעוד CD45l מתייחס לעוצמה של CD45RA עבור תת-קבוצות CD34+CD38. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
7. ניתוח סטטיסטי
הערה: הבדיקה הסטטיסטית של הנתונים המופקים כוללת צינור ניתוח מותאם אישית, המקודד באמצעות שפת התכנות Python (קובץ משלים 2, קובץ משלים 3 וקובץ משלים 4). הסקריפט מאורגן בשלושה בלוקים: הראשון לעיבוד הגיליון האלקטרוני, הבלוק השני ליצירת מפת החום להדמיית נתונים, והבלוק האחרון ליצירת היסטוגרמות מרובות לניתוח ובדיקה של מאפייני בידול וחלוקה.
מיון FACS
אסטרטגיות המיון המוצגות בפרוטוקול זה מבוססות על אסטרטגיות מקובלות 12,30,31. עבור אסטרטגיית הגאטינג המוצגת באיור 1, חומר המוצא הוא אבות דם טבורי שטוהרו בעבר באמצעות העשרה מגנטית CD34+, מה שמסביר את האחוז הזניח של תאים חיוביים לשושלת. חיוני להשתמש בשערים הדוקים עבור ארבעת שילובי הצבעים התוך-תאיים (למשל, ה-CTV באיור), כדי לשפר את רזולוציית הפסגות במהלך הניתוח הבא ולשער את אוכלוסיית התאים הנכונה (איור 1D). במקרה המוצג באיור, השערים בוחרים עבור האוכלוסייה הגדולה והמוגדרת יותר. הימצאותן של אוכלוסיות מרובות וקרובות לכל שילוב צבעים של חלוקת תאים אינה מייצגת, מניסיוננו, הבדלים ביולוגיים. במקום זאת, זה יכול להצביע על א) הליך צביעה לא אופטימלי, או ב) הטרוגניות גדולה (במיוחד בגודל) במאגר ההתחלתי של תאים. זה לא בלתי צפוי כאשר מתחילים מדם טבורי או ממקורות ביולוגיים מורכבים אחרים (למשל, מח עצם, דם היקפי). אם השער אינו מוגדר היטב, הדילול ההדרגתי של שילובי הצבעים השונים יכול להוביל למיזוג של הפסגות המאוחרות יותר, במיוחד עבור התנאים CV ו-VC (איור 2D). תוצאה שלילית נוספת של גטינג תת-אופטימלי היא חוסר היכולת להבחין ביעילות בין פסגות שונות לאחר תרבית תאים, שכן אוכלוסייה התחלתית הטרוגנית יכולה להוביל לפסגות רדודות.
איור 1: אסטרטגיית Gating למיון תאים. (A) FSC-A לעומת SSC-A, כדי למנוע פסולת ותאים מזהמים. (B) FSC-A לעומת FSC-H, כדי לא לכלול כפילויות וגושי תאים. (C) Lin לעומת FSC-H, כדי לא לכלול תאים שהם Lin+. (D) CTV לעומת CFSE, כדי לזהות באופן חד-משמעי את התאים המוכתמים בצירופי הצבעים CF, CV, VC ו-VI. השערים צריכים להיות קפדניים מספיק כדי לכלול אוכלוסייה הומוגנית. (E) CD34 לעומת CD38, כדי להפריד את האבות המוגבלים CD34+CD38+ (הנקראים גם HPC) מהתא הרב-פוטנטי CD34+CD38-. (F) CD45RA לעומת CD90, מאוכלוסיית CD34+CD38, כדי להפריד בין האבות הלא בשלים ביותר המועשרים ב-HSC (CD90+CD45RA-), LMPP (CD90באמצעCD45RA+), וה-MPP המחויב יותר (CD90-CD45RA-). (G) אינדקס ממוין אירועים, המיוצגים כאן עבור צביעת שילוב צבע התא שלהם ו- (H) ביטוי סמני פני השטח CD90 ו- CD45RA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
ניתוח ציטומטריית זרימה לאחר תרבית תאים
הנתונים באיור 2 מייצגים HSCs של דם טבורי אנושי, שנשמרו בתרבית במשך 72 שעות, בנוכחות ציטוקינים מרובים המסוגלים לתמוך במגוון של אבות ומבשרים מיאלואידים. לוחות 2A עד 2D מייצגים את ה-gating הדרוש כדי לבסס את הקרבה של כל אחד מהתאים הבודדים, בעוד שלוחות 2E עד 2G מאפשרים פנוטיפ תאי. הנוכחות המופחתת של חברי פרלמנט באיור היא ככל הנראה תוצאה של תנאי התרבית ששימשו לניסוי המייצג הזה (איור 2F). שימוש בציטוקינים שונים ובתנאי תרבית שונים משנים את האחוז היחסי של כל תת-קבוצה, בדומה לבחירת תאי התחלה שונים לניסוי.
איור 2: אסטרטגיית Gating לניתוח ציטומטריית זרימה. (A) FSC-A לעומת SSC-A, כדי להוציא פסולת ותאים מזהמים. (B) FSC-A לעומת FSC-H, כדי לא לכלול כפילויות וגושי תאים. (C) CTV לעומת CFSE, השער המסומן מאפשר לא לכלול כל אירוע פלואורסצנטי אוטומטי שעלול להשפיע על רזולוציית הנתונים. (D) CTV לעומת CFSE. חשוב מאוד לשער בקפדנות את ארבע האוכלוסיות, בהתבסס על דילולי הצבע של חלוקת התא. (E) CD34 לעומת CD38, כדי להבחין בין מבשרי מחויבות (CD34-), אבות מוגבלים (HPC) (CD34+CD38+), ואבות לא בשלים (CD34+CD38-). (F) CD45RA לעומת CD123, כדי להבחין בין שלושה סוגים של אבות מוגבלים: CMP (CD123+CD45RA-), MEP (CD123-CD45RA-), ו-GMP (CD123+CD45RA+). (G) CD45RA לעומת CD90, מ- CD34+CD38-, כדי לזהות HSCs, LMPPs ו- MPPs. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
שלבי הגדרת השיא וההקצאה (איור 3 ואיור 4) הם היבטים מכריעים של הפרוטוקול ומחייבים הגדרה של שערים קפדניים. עבור הגדרת השיא (איור 3), דרושים לפחות 1,000 אירועים לזיהוי אמין. במובן זה, זה יכול להיות מועיל לבודד תאים נוספים במהלך שלב מיון התא עבור בארות "בתפזורת". איור 4 מתאר ארבע דוגמאות של בארות בודדות המכילות משפחות מרובות. איור זה מבהיר את החשיבות של איור 2D ואיור 3, במיוחד לזיהוי של כל משפחה וכל פסגה. איור 4A מדגים דוגמה פשוטה, מאחר שכל התאים בשער CF קרובים מאוד זה לזה וניתן לשייך אותם בקלות לפסגה אחת. איור 4C מראה דוגמה נוספת למשפחה המחולקת באופן חד-משמעי על שתי פסגות מופרדות היטב, כפי שהיא מוצגת בבירור בהיסטוגרמה של איור 4D. איור 4E,G חושף את החשיבות של הקפדה על מספר רב של אירועים; שניהם מציגים מעט אירועים קרובים, אך מחוץ לשערי שילוב הצבעים. אירועים אלה יכולים להיכלל באופן שגוי בשערי VI ו- CF, בהתבסס אך ורק על ניתוח באר יחידה. לבסוף, איור 4F,H מציג שתי דוגמאות שונות של משפחות המפוזרות על פסגות מרובות, עם דוגמה אחת של שתי פסגות עוצמה דומות (איור 4F) ואחת עם שתי פסגות עוצמה לא שוות (איור 4H).
איור 3: הגדרת שיא לניתוח ציטומטריית זרימה. (א-ד) יש להגדיר פסגות הרושמות לפחות 500 אירועים, כדי להבטיח ייצוג טוב לכל שיא בודד. (A) היסטוגרמה לעוצמת CFSE-A. ניתן לזהות מספר פסגות, שכל אחת מהן מתאימה לאוכלוסייה שונה של תאים מתחלקים. (ב,ג) היסטוגרמות לעוצמת הפרמטר הנגזר, המייצגות את תערובת CFSE-CTV, CV (B) ו- VC (C), בהתאמה. (D) היסטוגרמה לעוצמת CTV-A. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מטלת שיא. (A,B) ניתן לזהות רק שיא אחד עבור באר זו, בשער CF. (ג,ד) שתי פסגות בעוצמות כמעט שוות ניתן לזהות בבאר זו, בשער VI. הפסגות נפתרות היטב. (ה,ו) שתי פסגות בעוצמה דומה ניתן לזהות בבאר זו, בשער VI. רק האירועים בשער נלקחו בחשבון, בהתבסס על האסטרטגיה שנקבעה באמצעות בארות הצובר . (ז-ח) שתי פסגות של עוצמה לא שוות ניתן לזהות בבאר זו, בשער CF. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
ייצוג נתונים ובדיקות סטטיסטיות
איור 5 מראה סוגים שונים של ייצוג נתונים של שני ניסויים נפרדים, שניהם בוצעו לאחר 72 שעות של תרבית תאים. HSCs ו-MPPs גודלו בתרבית בשתי תרביות תאים שונות, שאמורות לשנות את תכונות חלוקת התא והתמיינותו. מדיות אלה נקראות "Diff" (בידול)32 ו-"GT"33; הראשון מקדם התמיינות מיאלואידית ואריתרואידית, מכיוון שהוא מכיל אריתרופויאטין (EPO) וגורם מגרה מושבה גרנולו-מונוציטית (GM-CSF), ואילו השני פותח בהקשר של ניסויים קליניים בריפוי גנטי, במטרה לשמר ולהגביר אחוז גבוה של HSPCs. איור 5A הוא מפת חום מייצגת עבור המצב "Diff", המייצג מגוון משפחות תאים, הן בגורלות תאים והן בחלוקות. במפת חום זו, כל שורה מייצגת משפחה בודדת, כל ריבוע תא בודד, והעמודות מקבצות את כל התאים הנמצאים באותו דור (לדוגמה, תאים בדור 2 מחולקים לפחות פעמיים). ניתן להבחין בין משפחות הומוגניות מאוד, המורכבות מסוג תא יחיד ומציגות את אותו מספר חלוקות (למשל, משפחה #63), לבין משפחות הטרוגניות, כולל שלושה סוגי תאים במשך שני דורות (למשל, משפחה #84). מאחר ששיעור ההתאוששות התאית בניתוח זה הוא כ-70%, משפחות שלמות, המוגדרות על-ידי כך שכל התאים שלהן התאוששו בדורות שונים (למשל, משפחה של תא אחד בדור 1 ושני תאים בדור 2), נצפות רק לעתים רחוקות (הצגת האשטאג ליד מספר הזהות שלהן באיור 5A). ישנם הסברים רבים המסבירים את הגילוי החלקי, אשר יכול להיות טכני (בעיית צביעה, אובדן תאים עקב הפרוטוקול) או ביולוגי (מוות תאי ו / או אפופטוזיס). ניתן להתגבר על מגבלות טכניות באמצעות אנלייזר שנועד להפחית את הנפח המת המשויך לדגימה הבודדת, ועל ידי ביצוע צביעת התא ישירות בלוח תרבית התא כדי להפחית את צנרת הנפח. לעומת זאת, שיטות אורתוגונליות לקביעת כמות המוות של תאים (למשל, באמצעות ניסויי הדמיה של תאים חיים) יכולות לעזור להבחין בין הגורמים הטכניים והביולוגיים שתוצאתם גילוי חלקי.
איור 5Bi מראה כיצד לדמיין את ההשפעה של מצב התרבית על הרכב סוג התא, כאילו מישהו ביצע בדיקה בתפזורת. כאן, תנאי Diff מקדם מספר גדול יותר של גורלות, ואחוז גבוה יותר של תאי CD34+ (המוגדרים ככל סוגי התאים למעט CD34-). מרווחי בר-סמך מחושבים בסקריפט באמצעות רצועת אתחול בסיסית, עם 250,000 מערכי נתונים של bootstrapped34. ראוי לציין שכל שאר ההיסטוגרמות באיור 5 מציגות רווחי סמך המחושבים באותו אופן. טבלה 5 משחזרת את כל המידע על מספר המשפחות ומספר התאים בכל דור.
איור 5Bii מייצג באופן גרפי את תפוקת הבדיקות הסטטיסטיות שבוצעו בסקריפט "2_bar_plot". תיאור רשמי של המסגרת הסטטיסטית זמין26. בקצרה, מסגרת זו מאפשרת בדיקת השערות סטטיסטיות תוך הנחה שתאים מאותה משפחה הם תלויים (הנחה שהיא עצמה ניתנת לבדיקה), בניגוד לסטטיסטיקה הקלאסית המחייבת עצמאות בין כל התאים הנצפים. במקרה הספציפי המוצג באיור, הבדיקה הסטטיסטית מאתגרת את ההשערה כי בחירות גורל התא של MPPs, הנמדדות כתדרים של סוגי התאים השונים הקיימים בתרבית, אינן תלויות בתנאי תרבית התא שבהם נעשה שימוש. ראשית, סטטיסטיקת מבחן G משמשת להערכת הפער בין תדרי סוג התא ממדיות תא שונות (לדוגמה ב- Bii, סטטיסטיקה זו מיוצגת באמצעות הסרגל האדום). לאחר מכן, אקראיות של הנתונים מתבצעת באמצעות תמורות, החלפת משפחות שלמות של תאים בין שני תנאי תרבית התא. זאת כדי לשמר את התלות בין תאים הקשורים למשפחה, תוך שמירה על מספר המשפחות בכל קבוצה עקבי עם הנתונים המקוריים. סטטיסטיקת מבחן G מחושבת מתוך ערכת הנתונים האקראית. הערכים הכחולים המיוצגים ב- 5Bii הם סטטיסטיקת מבחן G עבור 250,000 תמורות. לבסוף, ערך p מחושב כדי להעריך את המידה שבה מערך הנתונים המקורי חורג מההתפלגות של הנתונים הקבועים. בדוגמה, הסטטיסטיקה המקורית סוטה במידה רבה מההתפלגות, וכתוצאה מכך ערך p קטן ובכך דוחה את ההשערה שגורל התא של MPPs אינו תלוי בתנאי התרבית.
איור 5C מייצג את אחוז משפחות התאים בכל דור מרבי, כדי לחקור כיצד תנאים שונים משנים את חלוקת התאים לכל משפחת תאים. תרשים נתונים זה מראה כי ב 72 שעות, התאים בתרבית במצב Diff להשלים מספר גדול יותר של חלוקות מאשר תאים במצב GT. מיוצג הוא מספר הדורות המרבי לכל משפחה, כך שמשפחה אחת המציגה תאים בדורות 1 ו -2 נחשבת דור 2. אותה מסגרת סטטיסטית שבה נעשה שימוש באיור 5B יכולה לשמש לבדיקה סטטיסטית של העצמאות בין חלוקת התאים למצב התרבית.
איור 5D בוחן את סוג הסימטריה/אסימטריה של החלוקה הראשונה עבור סוגי האבות הקדמונים השונים (HSCs או MPPs). עבור משפחות התאים השלמות בדור 1 – הדור היחיד שבו ניתן לקבוע בוודאות את שני תאי הבת כתאי אחות – ניתן להגדיר ארבעה סוגים שונים של סימטריה/אסימטריה: התווית "Sym Undiff" מתארת משפחות שבהן שתי הבנות שומרות על הפנוטיפ של תא המוצא. "סים דיף" פירושו שלשתי הבנות יש אותו פנוטיפ, והוא שונה מתא המוצא. "Asym Undiff" פירושו שבת אחת שומרת רק על הפנוטיפ של תא המוצא. לבסוף, "Asym Diff" מתאר משפחות שבהן לשתי הבנות יש פנוטיפים שונים, ואף אחד מהם אינו זהה לתא המוצא. כדי להשיג כוח סטטיסטי בהערכת גורלות סימטריים/א-סימטריים אלה, רצוי לבצע את ניתוח המולטי-ג'ן בנקודות זמן מוקדמות, על מנת לצפות ביותר משפחות שצאצאיהן נמצאים בדור 1.
לבסוף, איור 5E מייצג את האחוזים של סוגי תאים כפונקציה של מספר החטיבות, כדי לקבל תובנות על התקדמות דפוס ההתמיינות בין חלוקות. לדוגמה, הנתונים המוצגים באיור מצביעים על כך שתאים מתקדמים למצב CD34, כאשר מעל 50% מהתאים שזוהו בכיתה זו לאחר שלוש חלוקות בלבד. יתר על כן, ניתן להסיק כי MPPs אינם מעדיפים חלוקה של התחדשות עצמית, שכן אחוז קטן של תאים לשמור על הפנוטיפ המקורי. חלק ממסקנות אלה ניתן לבחון באמצעות המסגרת הסטטיסטית שהוצגה בנתונים הקודמים.
איור 5: דוגמה לייצוג נתונים עבור ניסוי אחד של 72 שעות באמצעות HSPCs מדם טבורי. (A) מפות חום עבור מערך נתונים נבחר (HSC, בתווך "Diff", לאחר 72 שעות של תרבית). החלקות מייצגות את כל התאים הבודדים (ריבועים) על פי קרבתם (שורות), מספר החלוקות שבוצעו (עמודות, הנקראות דור) ופנוטיפ (צבעים). (בי) היסטוגרמה המשווה פרופורציות של סוגי התאים של צאצאי התא של HSCs ו- MPPs, בין המצב GT לבין המצב Diff. (Bii) הגרף מייצג את הבדיקות הסטטיסטיות שבוצעו בסקריפט "2_bar_plot" עבור MPPs בתרבית 72 שעות, בהשוואה בין קוקטיילים ציטוקינים "Diff" ו- "GT". ערך הניסוי מוצג באדום, והערכים נוצרים באמצעות 250,000 תמורות בכחול. ערך p של מבחן G מצוין בפינה הימנית העליונה עם מספר המשפחות ששימשו לבדיקה. (C) היסטוגרמה המשווה את אחוז המשפחות (314 משפחות בסך הכל) בכל דור (מקודד בצבע), עבור HSCs ו- MPPs לכל תנאי תרבית. מרווחי בר-סמך מחושבים באמצעות 250,000 ערכות נתונים עם אתחול. (D) היסטוגרמה המייצגת את סוג הסימטריה/אסימטריה בין גורל תאי הבת למשפחות בעלות שני תאים בדור 1: סים אונדיף (שתי הבנות שומרות על הפנוטיפ של תא המוצא), סים דיף (לשתי הבנות יש אותו פנוטיפ, והוא שונה מתא המוצא), אסים אונדיף (רק בת אחת שומרת על הפנוטיפ של תא המוצא), ו- Asym Diff (לשתי הבנות יש פנוטיפים שונים ואף אחד מהם אינו דומה לתא המוצא). (ה) היסטוגרמות של תרומתם של סוגי תאים המסווגים לדור עבור MPPs שגודלו בתרבית עם קוקטייל "Diff"; n = 204 תאים ו-97 משפחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 5: תיאור מספר המשפחות והתאים שנותחו לכל תנאי ניסוי (תא מקור ותווך תרבית תאים). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
קובץ משלים 1: אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 2: לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 3: אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 4: לחץ כאן להורדת קובץ זה.
בדיקת MultiGen היא בדיקה בעלת תפוקה גבוהה, קלה לביצוע ולא יקרה, שסייעה לחקור לימפוציטים 23,24,35 ותאים המטופויטיים מורין26,27. כאן אנו מציגים פיתוח חדש של הגישה המאפשרת לפענח ex vivo את השלב המוקדם של מחויבות HSPC אנושית, ברמת התא הבודד באמצעות תרבית לטווח קצר (איור 6). מערכות תרבית אקס-ויו של תא בודד משמשות בדרך כלל להערכת גורלם ארוך הטווח של HSPCs לתאים בוגרים, אך חלק מהגורלות מתרחשים מוקדם יותר מאחרים36, מה שעלול להטות את הניתוח לכיוון פחות גורלות. בנוסף, מערכות תרבות אלה בדרך כלל מפספסות מידע על מחלוקות במהלך מחויבות גורל. צעדי המחויבות הראשונים הוכחו כמתרחשים כבר בתחילת התרבות, לעתים ללא חלוקה26,37, מה שהופך את התרבות לטווח קצר ואת חלוקת המעקב לחיונית לחקר מחויבות הגורל המוקדם. על ידי מעקב בו זמנית אחר הגורל, החלוקה והקרבה, בדיקה זו מאפשרת להבין את תפקידה של החלוקה הראשונה והחלטת הגורל ב- HSPCs אנושיים. באמצעות הבדיקה ניתן להסיק לאחר כמה חלוקות מתרחש תהליך המחויבות, את האיזון בין התחדשות עצמית לבין בידול עבור אותם אבות מוקדמים, וכיצד תכונות אלה עוברות בירושה לאורך דורות. למיטב ידיעתנו, זהו המבחן היחיד המאפשר מדידות מסוג זה עבור HSPCs אנושיים, ברזולוציה של תא בודד. בנוסף, באמצעות שילובים שונים של צבעי חלוקת תאים, הגדלנו את התפוקה של הניתוח, מה שהופך את הבדיקה הזו לכלי רב ערך ליצירת מערכי נתונים גדולים במהירות. שילובי הצבעים מאפשרים לעקוב אחר מספר משפחות באותן בארות, ולהגדיל את מספר התאים הזמינים לניתוח בתרבית לטווח קצר. מספר השילובים יכול להיות גדול עוד יותר, על ידי הוספת צבעים אחרים (למשל, צבע צהוב) או שינוי היחס בין CFSE ו- CTV. עם זאת, זה מקטין את מספר הפרמטרים האחרים שניתן לנתח.
איור 6: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
כדי לבצע את הניתוח בהצלחה, בשל מספר גדול של בארות ואת מספר מופחת של תאים לנתח, יש צורך להפעיל את ניתוח ציטומטריה זרימה על מנתח מצויד קורא לוחות. הדור החדש של מנתחי ספסל מותאם במיוחד לבדיקה זו, מכיוון שלרובם יש נפח מת קטן יותר כדי להפחית את אחוז אובדן התאים. זה בתורו מבטיח יעילות גבוהה יותר בשחזור כל באר, מה שמביא ליעילות המוערכת בטווח של70% 26. הערכת אובדן התאים במהלך רכישת ציטומטריית הזרימה חיונית לניתוח של כל משפחה בנפרד. לדוגמה, בהנחה שאין מוות תאי וסופרים את מספר החלוקות, ניתן להעריך את מספר התאים לכל משפחה. עם זאת, רצוי לבצע כמה ניסויים מאששים, במיוחד בהערכת מוות תאי בתנאי התרבית הנבדקת ומדידת קצב ההתאוששות באופן ניסיוני באמצעות מספר מוגדר של תאים.
אחד השלבים המכריעים של פרוטוקול זה הוא הקצאת השיא. כאמור, התפלגות שיא באיכות טובה תלויה מאוד בבידוד של פסגות צרות מאוד במיון תאים. עם זאת, עדיין קשה להקצות את המספר הנכון של חטיבות בהתבסס באופן ייחודי על ההתפלגות. מכיוון שמיון תאים וניתוח ציטומטריית זרימה מבוצעים בשתי מכונות שונות, לא ניתן להשוות ישירות את עוצמת כל אות, כך שיהיה קשה לדעת אם השיא הראשון שנצפה בקצה הימני של ההיסטוגרמה הוא שיא 0 או שיא 1. בהקשר זה, פתרונות מעטים אפשריים; דרך אחת היא לבצע ניסוי אורתוגונלי כדי למדוד במדויק את מספר החלוקות המבוצעות על ידי תאים אלה (למשל, דימות תאים חיים). אפשרות נוספת היא פשוט לספור את מספר התאים בבאר תחת מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך, לפני ביצוע ניתוח ציטומטריית זרימה. זה יסיק מספר ממוצע של חלוקות (בהנחה שאין מוות תאי). לבסוף, פתרון פוסט-הוק להקצאת שיא הוא איתור מספר חריג של "משפחות בלתי אפשריות"; משפחות אלה מורכבות ממספר גדול מהאפשרי של תאים בכל דור (למשל, חמישה תאים בדור 2, או שני תאים בדור 1 ותא אחד בדור 2). האפשרות להחריג משפחות בלתי אפשריות מקודדת בשלב הניתוח הסטטיסטי, ומסמנת את המשפחה הבלתי אפשרית. אם ההתרחשות של שגיאות אלה גבוהה מדי, סביר להניח כי הקצאת השיא צריכה להיות מתוקנת.
בפרוטוקול זה, כללנו כמה דוגמאות של ייצוג וניתוח נתונים עבור הבדיקה, שכן זה הפך להיות צעד חיוני ביצירה ופרשנות של מערכי נתונים גדולים38. הדוגמה הראשונה היא מפת החום המציגה את מכלול התאים המנותחים, המאורגנים לפי משפחה. זהו כלי יעיל לחקור את המאפיינים הכלליים של הנתונים ואת המסקנות האפשריות: האם משפחות מורכבות מסוגי תאים מרובים או שהן נוטות להיות הומוגניות בהרכבן? האם משפחות מפוזרות על פני דורות רבים, או שהן מתחלקות לרוב באותו מספר פעמים? ניתוח גישוש זה צריך להיות משלים עם חלקות ספציפיות יותר ובדיקות סטטיסטיות. ניתן להשתמש בו כדי להעריך כמותית מחויבות גורל סימטרית וא-סימטרית, דיפרנציאציה ללא חלוקה, האיזון בין התחדשות עצמית להתבדלות, ומספר החלוקות עבור גורל מחויבות נתון. זה בסיסי, במהלך תכנון הניסוי, להגדיר את אורך תרבית התא בהתאם לסוג השאלה שנשאלה; לדוגמה, בשתי השאלות הראשונות (איזון סימטרי/א-סימטרי ודיפרנציאציה ללא חלוקה), תכנון צעדי תרבות קצרים מאוד מאפשר בידוד של מספר רב של משפחות שביצעו רק חלוקה אחת או כלל לא ביצעו חלוקה כלל26. לעומת זאת, ניסויים ארוכים יותר מאפשרים לחקור את מספר החלוקות הדרושות למחויבות תא מסוים, שכן הם דוגמים משפחות בשלבים שונים של התמיינות. עם זאת, שיטה זו אינה מיועדת לתרביות ארוכות טווח (2-3 שבועות), מכיוון שדילול צבע התא אינו מסוגל לעקוב במדויק אחר יותר משבע או שמונה חטיבות22. כתוצאה מכך, כלי זה מותאם בעיקר לחקר המחויבות המוקדמת של אבות hematopoietic, והוא לא נועד להסיק מסקנות מוצקות על תכונות התמיינות לטווח ארוך של תאים אלה.
המסגרת הסטטיסטית פותחה במיוחד לניתוח נתונים מסוג זה ומבוססת על הרעיון של תמורות26. זה היה הכרחי בגלל התצפית של תלות משפחתית על התפלגות סוג התא ועל מספר החטיבות שבוצעו. במילים אחרות, תאים שהם חלק מאותה משפחה נוטים יותר להציג פנוטיפים דומים ולהתחלק באותו מספר פעמים. בעוד ניתוח מעמיק הוא מעבר להיקף של עבודה זו, קבוצה מסופקת של בדיקות סטטיסטיות צריך להיות מספיק בעת הערכת תנאים שונים.
לסיכום, פרוטוקול זה מהווה כלי רב ערך להערכת הדינמיקה התאית של תאי גזע המטופויטיים ותאי אב ex vivo, בצורה מהירה וזולה. בשל גמישותו ורבגוניותו לגבי נקודת זמן, תנאי תרבית וסוג HSPCs שנותחו, הוא מאפשר לבדוק מגוון תנאי ניסוי. כניסוי מבוסס ציטומטריית זרימה, ניתן ליישם אותו ברוב המעבדות, והוא אינו דורש ידע מוקדם נרחב, מה שהופך אותו למועמד טוב לבדיקות סקר וניסויי פיילוט.
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים רלוונטי לעבודה זו. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובפרשנותם, או בהחלטה להגיש את העבודה לפרסום.
ברצוננו להודות לחברי מכון קירי על עזרתם בהקמת ניסויי ציטומטריית הזרימה. אנו רוצים גם להכיר בתרומתם של חברי הצוות האחרים, במהלך דיונים מרובים. אנו מודים לד"ר ג'וליה מרצ'ינגו ולפרופ' פיל הודג'קין (מכון וולטר אנד אלייזה הול למחקר רפואי) על שיתוף הפרוטוקול שלהם של ריבוב צבעי חלוקת תאים על לימפוציטים. אנו מודים לביובנק הדם הטבורי של בית החולים סנט לואיס על אספקת המשאבים הביולוגיים הדרושים לפיתוח פרוטוקול זה. המחקר נתמך על ידי מענק ATIP-Avenir מ-CNRS ומקרן Bettencourt-Schueller (ל-L.P.), מענקים מ-Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) (ל-L.P. ו-A.D.), Idex Paris-Science-Lettres Program (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) (ל-L.P.), Canceropole INCA Emergence (2021-1-EMERG-54b-ICR-1, ל-L.P.), ומענק ITMO MIIC (21CM044, ל-L.P). בנוסף למימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי ERC StG 758170-Microbar (ל- L.P.), A.D. נתמכה על ידי מלגה מקרן דה פראנס.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes | vWR | 87003-294 | |
15-mL polypropylene tubes | vWR | 734-0451 | |
50-mL polypropylene tubes | vWR | 734-0448 | |
96-well U-bottom culture plate | Falcon | 353077 | |
Anti-human Lin APC | Thermo Fisher | 22-7776-72 | Dilution 1/40 |
ARIA III | BD | Can be replaced with any FACS sorter able to sort individual cells in 96-wells plate | |
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Life Technologies | C34570 | |
Cell Trace Violet (CTV) | Life Technologies | C34571 | |
Compensation beads | BD | 552843 | |
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Life Technologies | 11320033 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Thermo Scientific | J62948-36 | Prepare a solution 0.5 M, in sterilised water |
FC block Fc1.3216 | BD | 564220 | Dilution 1/50 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | S1900-500C | Batch S00CH |
FlowJo v10.8.1 | BD | ||
Mouse anti-human CD10 PerCP-5.5, clone HI10a | Biolegend | 312216 | Dilution 1/20 |
Mouse anti-human CD123 BUV395, clone 7G3 | BD | 564195 | Dilution 1/15 |
Mouse anti-human CD34 APC-Cy7, clone 581 | Biolegend | 343513 | Dilution 1/40 |
Mouse anti-human CD38 BV650, clone HB7 | Biolegend | 356620 | Dilution 1/40 |
Mouse anti-human CD45RA AF700, clone HI100 | BD | 560673 | Dilution 1/20 |
Mouse anti-human CD45RA PE-Cy7, clone HI100 | BD | 560675 | Dilution 1/20 |
Mouse anti-human CD90 PE, clone 5E10 | Biolegend | 328110 | Dilution 1/20 |
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Life Technologies | 10010001 | |
Python | |||
R | |||
Sterile 12x75 mm conical polypropylene tubes | Falcon | ||
ZE5 | Biorad | Can be replaced with any flow cytometry analyzer equipped with a plate reader | |
Laboratory prepared | |||
Cell culture media | Depends from the specific experiment. Prepare fresh daily and store at +4 °C until use | ||
DMEM + 10% FBS | Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 50 mL of FBS to 450 mL DMEM | ||
PBS 1X + EDTA 0.1% | Can be stored in sterile conditions, at room temperature, up to 1 year. To prepare 500 mL, add 3.42 mL of EDTA 0.5 M to 500 mL PBS 1X | ||
Staining buffer | Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 2 mL of EDTA 0.5 M and 1 mL FBS to 500 mL PBS 1X |
Tags
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved