JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Immunology and Infection

توليد المتصورة المعدلة وراثيا بيرغي سبوروزويتات

Published: May 5th, 2023

DOI:

10.3791/64992

1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

تنتقل الملاريا عن طريق تلقيح مرحلة sporozoite من البلازموديوم بواسطة البعوض المصاب. لقد سمحت لنا البلازموديوم المعدلة وراثيا بفهم بيولوجيا الملاريا بشكل أفضل وساهمت بشكل مباشر في جهود تطوير لقاح الملاريا. هنا ، نصف منهجية مبسطة لتوليد المتصورة المعدلة وراثيا Sporozoites المعدلة وراثيا.

الملاريا مرض قاتل يسببه طفيلي البلازموديوم وينتقل عن طريق لدغة أنثى بعوض الأنوفيلة . تخضع مرحلة sporozoite من Plasmodium التي يرسبها البعوض في جلد مضيفات الفقاريات لمرحلة من التطور الإلزامي في الكبد قبل بدء الملاريا السريرية. نحن نعرف القليل عن بيولوجيا تطور البلازموديوم في الكبد. يعد الوصول إلى مرحلة sporozoite والقدرة على تعديل هذه الأسبوروزويتات وراثيا من الأدوات الحاسمة لدراسة طبيعة عدوى المتصورة والاستجابة المناعية الناتجة في الكبد. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لتوليد المتصورة المعدلة وراثيا Sporozoites المعدلة وراثيا. نقوم بتعديل مرحلة الدم وراثيا P. berghei ونستخدم هذا النموذج لإصابة بعوض الأنوفيليس عندما يتناولون وجبة دم. بعد أن تخضع الطفيليات المعدلة وراثيا للتطور في البعوض ، نقوم بعزل مرحلة sporozoite من الطفيلي من الغدد اللعابية للبعوض لإجراء تجارب في الجسم الحي وفي المختبر . لقد أثبتنا صحة البروتوكول من خلال توليد sporozoites من سلالة جديدة من P. berghei تعبر عن الوحدة الفرعية 11 من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) (GFP11) ، ونوضح كيف يمكن استخدامها للتحقيق في بيولوجيا الملاريا في مرحلة الكبد.

وعلى الرغم من التقدم المحرز في تطوير الأدوية والبحوث في مجال الوقاية من الملاريا وعلاجها، لا يزال عبء الملاريا العالمي مرتفعا. يموت أكثر من نصف مليون شخص بسبب الملاريا كل عام، مع أعلى مستويات الوفيات بين الأطفال الذين يعيشون في المناطق الموبوءة بالملاريا، مثل أفريقيا جنوب الصحراءالكبرى 1. تحدث الملاريا بسبب طفيلي البلازموديوم ، الذي ينتقل إلى البشر من خلال لدغة أنثى بعوض الأنوفيليس التي تحمل الطفيلي في الغدد اللعابية. تترسب المرحلة المعدية من المتصورة - sporozoites - في جلد مضيفات الفقاريات أثناء تناول وجبة الدم وتنتقل عبر مجرى الدم لإصابة خلايا الكبد ، حيث تخضع لتطور إلزامي (تشكل الملاريا قبل كر....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم إجراء جميع الأبحاث التي شملت الحيوانات الفقارية في مختبرنا وفقا لإرشادات وبروتوكولات استخدام الحيوانات بجامعة جورجيا.

1. جيل من الفئران المصابة ب P. berghei

  1. بدء عدوى مرحلة الدم في ذكور أو إناث ، الفئران C57BL / 6 (B6) البالغة من العمر 6-8 أسابيع باستخدام طفيليات

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يعد تحديد تواتر وتطور الفصام أمرا بالغ الأهمية لضمان وجود ما يكفي من الطفيليات القابلة للحياة في المرحلة المثلى للنقل. يمكن تمييز الفصاميات غير الناضجة عن الفصاميات الناضجة تماما من خلال وجود عدد أقل من الميروزويتات التي لا تملأ المساحة داخل الخلايا بالكامل لكرات الدم الحمراء (

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لقد استخدمنا البروتوكول أعلاه في مختبرنا لإنشاء عدة خطوط من طفيليات P. berghei المعدلة وراثيا. على الرغم من أنه تم تحسينه ل P. berghei ، فقد استخدمنا هذا البروتوكول بنجاح لتوليد P. yoelii sporozoites المعدلة وراثيا. بعد حقن الفصاميات المنقولة في الفئران ، يمكن اكتشاف الطفيليات عادة في موعد لا .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة AI168307 إلى SPK.  نشكر نواة قياس التدفق الخلوي UGA CTEGD ونواة الفحص المجهري UGA CTEGD. كما نعترف بمساهمات آش باثاك وآن إليوت وموظفي UGA Sporocore في تحسين البروتوكول. نود أن نشكر الدكتور دايتشي كامياما على الأفكار القيمة والمناقشة والبلازميدات الأم التي تحتوي على GFP11 و GFP 1-10. نود أيضا أن نشكر أعضاء مختبر Kurup على دعمهم المستمر وصبرهم وتشجيعهم.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
30 G x 1/2" Syringe needleExel international26437
Alsever's solutionSigma-AldritchA3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2LonzaVMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)TCI AmericaT1420
Blood collection tubesBD bioscience365967for serum collection
C-Chip disposable hematocytometerINCYTODHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture DishGreiner Bio-One627860
Centrifuge 5425Eppendorf5405000107
Centrifuge 5910REppendorf5910RFor gradient centrifugation
Delta Vision II - Inverted microscope systemOlympusIX-71
Dimethyl SulfoxideSigmaD5879-500ml
Fetal bovine serumGenClone25-525
GFP11 plasmidKurup LabpSKspGFP11Generated from PL0017 plasmid
Giemsa StainSigma-Aldritch48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cellsKurup LabHepa GFP1-10Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse SerumUsed for mosquito dissection media
NaClMillipore-SigmaSX0420-51.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector IIAmaxa Biosystems (Lonza)Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipetteVWR14673-043
Penicillin/StreptomycinSigma-AldritchP0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium)Cytivia17-0891-02Details in protocol
PL0017 PlasmidBEI ResourcesMRA-786
Pyrimethamine (for oral administration)Sigma46706Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640Corning15-040-CV
SoftWoRx microscopy softwareApplied Precisionv6.1.3

  1. WHO. Geneva. World Health Organization. , 1 (2020).
  2. Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
  3. Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
  4. Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. Pre-erythrocytic vaccines against malaria. Vaccines. 8 (3), 400 (2020).
  5. Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
  6. Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
  7. Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
  8. Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
  9. Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
  10. Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
  11. Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
  12. Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
  13. Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
  14. Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
  15. Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
  16. Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
  17. Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
  18. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  19. Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
  20. Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
  21. de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
  22. Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
  23. Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
  24. Bowers, C., et al. Cryopreservation of Plasmodium sporozoites. Pathogens. 11 (12), 1487 (2022).
  25. Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved