Generering af genetisk modificerede Plasmodium berghei sporozoitter

Malaria overføres gennem podning af sporozoitstadiet af Plasmodium af inficerede myg. Transgen Plasmodium har gjort det muligt for os at forstå malariaens biologi bedre og har bidraget direkte til udviklingen af malariavacciner. Her beskriver vi en strømlinet metode til at generere transgene Plasmodium berghei sporozoitter.

Malaria er en dødelig sygdom forårsaget af parasitten Plasmodium og overføres gennem bid af kvindelige Anopheles myg. Det sporozoitiske stadium af Plasmodium deponeret af myg i huden hos hvirveldyrværter gennemgår en fase med obligatorisk udvikling i leveren, inden klinisk malaria påbegyndes. Vi ved lidt om biologien bag Plasmodiums udvikling i leveren; adgang til sporozoitstadiet og evnen til genetisk modifikation af sådanne sporozoitter er kritiske værktøjer til at studere arten af Plasmodium-infektion og det resulterende immunrespons i leveren. Her præsenterer vi en omfattende protokol til generering af transgene Plasmodium berghei sporozoitter. Vi genetisk modificerer blodstadiet P. berghei og bruger denne form til at inficere Anopheles myg, når de tager et blodmåltid. Efter at de transgene parasitter har gennemgået udvikling i myggene, isolerer vi parasittens sporozoitstadium fra myggens spytkirtler til in vivo - og in vitro-forsøg . Vi demonstrerer protokollens gyldighed ved at generere sporozoitter af en ny stamme af P. berghei , der udtrykker det grønne fluorescerende protein (GFP) underenhed 11 (GFP₁₁), og viser, hvordan det kan bruges til at undersøge biologien bag malaria i leverstadiet.

På trods af fremskridt inden for lægemiddeludvikling og forskning i malariaforebyggelse og -behandling er den globale sygdomsbyrde ved malaria fortsat høj. Over en halv million mennesker dør af malaria hvert år, med de højeste niveauer af dødelighed set blandt børn, der bor i malaria-endemiske regioner, såsom Afrika syd for Sahara¹. Malaria er forårsaget af parasitten Plasmodium, som overføres til mennesker gennem bid af kvindelige Anopheles myg, der bærer parasitten i deres spytkirtler. Det infektiøse stadium af Plasmodium - sporozoitterne - deponeres i hvirveldyrværternes hud under et blodmålti....

Al forskning, der involverer hvirveldyr i vores laboratorium, blev udført i overensstemmelse med University of Georgias retningslinjer og protokoller for dyrebrug.

1. Generering af P. berghei-inficerede mus

1. Start infektion i blodstadiet hos han- eller hunmus, 6-8 uger gamle C57BL/6 (B6) ved hjælp af vildtype P. berghei-parasitter. For at gøre dette overføres kryopræserveret P. berghei-inficeret blod (2 x 10⁵ inficerede RBC'.......

Bestemmelse af hyppigheden og udviklingen af schizonts er afgørende for at sikre, at nok levedygtige parasitter er i det optimale stadium til transfektion. Umodne skizonter kan differentieres fra fuldt modne schizonts ved tilstedeværelsen af færre merozoitter, der ikke fylder hele RBC's intracellulære rum (figur 1B). Det er vigtigt at bemærke, at når der foretages blodudstrygninger fra dyrket blod, kan inficerede RBC'er bryde op, hvilket resulterer i observation af frie, ekstracellulæ.......

Vi har brugt ovenstående protokol i vores laboratorium til at skabe flere linjer af transgene P. berghei parasitter. Selvom optimeret til P. berghei, har vi også med succes brugt denne protokol til at generere transgene P. yoelii sporozoitter. Efter injektion af de transfekterede skizonter i mus kan parasitter påvises typisk senest 3 d.p.i. i alle grupper, herunder ingen plasmidkontrol. Selektion påbegyndes først, når parasitæmi er blevet påvist for at sikre parasitternes levedygtighed .......

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-tilskuddet AI168307 til SPK.  Vi takker UGA CTEGD Flow Cytometry Core og UGA CTEGD Microscopy Core. Vi anerkender også bidragene fra Ash Pathak, Anne Elliot og personalet i UGA Sporocore i optimeringen af protokollen. Vi vil gerne takke Dr. Daichi Kamiyama for værdifuld indsigt, diskussion og de overordnede plasmider, der indeholder GFP₁₁ og GFP _1-10. Vi vil også gerne takke medlemmer af Kurup-laboratoriet for deres konstante støtte, tålmodighed og opmuntring.