Génération de sporozoïtes génétiquement modifiés à Plasmodium berghei

Le paludisme est transmis par l’inoculation du stade sporozoïte de Plasmodium par des moustiques infectés. Le plasmodium transgénique nous a permis de mieux comprendre la biologie du paludisme et a contribué directement aux efforts de développement d’un vaccin contre le paludisme. Nous décrivons ici une méthodologie simplifiée pour générer des sporozoïtes transgéniques de Plasmodium berghei .

Le paludisme est une maladie mortelle causée par le parasite Plasmodium et est transmis par la piqûre de moustiques anophèles femelles. Le stade sporozoïte de Plasmodium déposé par les moustiques dans la peau des hôtes vertébrés subit une phase de développement obligatoire dans le foie avant d’initier le paludisme clinique. Nous savons peu de choses sur la biologie du développement de Plasmodium dans le foie ; L’accès au stade de sporozoïte et la capacité de modifier génétiquement ces sporozoïtes sont des outils essentiels pour étudier la nature de l’infection à Plasmodium et la réponse immunitaire qui en résulte dans le foie. Nous présentons ici un protocole complet pour la génération de sporozoïtes transgéniques de Plasmodium berghei . Nous modifions génétiquement le stade sanguin de P. berghei et utilisons cette forme pour infecter les moustiques anophèles lorsqu’ils prennent un repas de sang. Une fois que les parasites transgéniques se sont développés chez les moustiques, nous isolons le stade sporozoïte du parasite des glandes salivaires des moustiques pour des expériences in vivo et in vitro . Nous démontrons la validité du protocole en générant des sporozoïtes d’une nouvelle souche de P. berghei exprimant la sous-unité 11 de la protéine fluorescente verte (GFP) (GFP₁₁), et montrons comment elle pourrait être utilisée pour étudier la biologie du paludisme au stade hépatique.

Malgré les progrès réalisés dans la mise au point de médicaments et la recherche sur la prévention et le traitement du paludisme, la charge mondiale du paludisme reste élevée. Plus d’un demi-million de personnes meurent du paludisme chaque année, les taux de mortalité les plus élevés étant observés chez les enfants vivant dans des régions où le paludisme est endémique, comme l’Afrique subsaharienne¹. Le paludisme est causé par le parasite Plasmodium, qui est transmis à l’homme par la piqûre de moustiques anophèles femelles porteurs du parasite dans leurs glandes salivaires. Le stade infectieux de Plas....

Toutes les recherches impliquant des animaux vertébrés dans notre laboratoire ont été effectuées conformément aux directives et protocoles d’utilisation des animaux de l’Université de Géorgie.

1. Génération de souris infectées par P. berghei

1. Initier l’infection au stade sanguin chez les souris mâles ou femelles C57BL/6 (B6) âgées de 6 à 8 semaines à l’aide de parasites P. berghei de type sauvage. Pour ce faire, transférer du.......

Il est essentiel de déterminer la fréquence et le développement des schizontes pour s’assurer qu’un nombre suffisant de parasites viables sont au stade optimal pour la transfection. Les schizontes immatures peuvent être différenciés des schizontes complètement matures par la présence d’un nombre réduit de mérozoïtes qui ne remplissent pas tout l’espace intracellulaire des globules rouges (figure 1B). Il est important de noter que lors de la réalisation de frottis sanguins.......

Nous avons utilisé le protocole ci-dessus dans notre laboratoire pour créer plusieurs lignées de parasites transgéniques P. berghei. Bien qu’il soit optimisé pour P. berghei, nous avons également utilisé avec succès ce protocole pour générer des sporozoïtes transgéniques de P. yoelii. Après avoir injecté les schizontes transfectés à des souris, les parasites sont généralement détectables au plus tard à 3 d.p.i. dans tous les groupes, y compris le témoin sans plasmide. La .......

Ce travail a été soutenu par les AI168307 de subvention des National Institutes of Health à SPK.  Nous remercions le noyau de cytométrie en flux CTEGD de l’UGA et le noyau de microscopie CTEGD de l’UGA. Nous reconnaissons également les contributions d’Ash Pathak, d’Anne Elliot et du personnel de l’UGA Sporocore dans l’optimisation du protocole. Nous tenons à remercier le Dr Daichi Kamiyama pour ses précieuses informations, ses discussions et les plasmides parents contenant la GFP₁₁ et la GFP _1-10. Nous tenons également à remercier les membres du laboratoire Kurup pour leur soutien constant, leur patience et leurs encourageme....