Gentechnisch veränderte Plasmodium berghei Sporozoiten

Malaria wird durch Inokulation des Sporozoitenstadiums von Plasmodium durch infizierte Stechmücken übertragen. Transgenes Plasmodium hat es uns ermöglicht, die Biologie der Malaria besser zu verstehen und hat direkt zur Entwicklung von Malaria-Impfstoffen beigetragen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine optimierte Methodik zur Generierung transgener Plasmodium berghei-Sporozoite.

Malaria ist eine tödliche Krankheit, die durch den Parasiten Plasmodium verursacht wird und durch den Stich weiblicher Anopheles-Mücken übertragen wird. Das Sporozoitenstadium von Plasmodium , das von Stechmücken in der Haut von Wirbeltierwirten abgelagert wird, durchläuft eine Phase der obligatorischen Entwicklung in der Leber, bevor die klinische Malaria beginnt. Wir wissen wenig über die Biologie der Plasmodienentwicklung in der Leber; Der Zugang zum Sporozoitenstadium und die Fähigkeit, solche Sporozoiten genetisch zu modifizieren, sind entscheidende Werkzeuge für die Untersuchung der Art der Plasmodium-Infektion und der daraus resultierenden Immunantwort in der Leber. In dieser Arbeit stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Generierung von transgenen Plasmodium berghei-Sporozoiten vor. Wir verändern P. berghei im Blutstadium genetisch und verwenden diese Form, um Anopheles-Mücken zu infizieren, wenn sie eine Blutmahlzeit zu sich nehmen. Nachdem sich die transgenen Parasiten in den Mücken entwickelt haben, isolieren wir das Sporozoitenstadium des Parasiten aus den Speicheldrüsen der Mücken für in vivo und in vitro Experimente. Wir demonstrieren die Validität des Protokolls durch die Generierung von Sporozoiten eines neuen Stammes von P. berghei , der die Untereinheit 11 (GFP₁₁) des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) exprimiert, und zeigen, wie es zur Untersuchung der Biologie der Malaria im Leberstadium verwendet werden kann.

Trotz Fortschritten in der Entwicklung von Medikamenten und der Forschung zur Malariaprävention und -behandlung ist die weltweite Krankheitslast durch Malaria nach wie vor hoch. Mehr als eine halbe Million Menschen sterben jedes Jahr an Malaria, wobei die höchste Sterblichkeitsrate bei Kindern beobachtet wird, die in Malaria-endemischen Regionen wie Afrika südlich der Sahara leben¹. Malaria wird durch den Parasiten Plasmodium verursacht, der durch den Stich weiblicher Anopheles-Mücken, die den Parasiten in ihren Speicheldrüsen tragen, auf den Menschen übertragen wird. Das infektiöse Stadium der Plasmo....

Alle Forschungen mit Wirbeltieren in unserem Labor wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Protokollen der University of Georgia zur Verwendung von Tieren durchgeführt.

1. Generierung von P. berghei-infizierten Mäusen

1. Initiierung einer Infektion im Blutstadium bei männlichen oder weiblichen, 6-8 Wochen alten C57BL/6 (B6)-Mäusen unter Verwendung von Wildtyp-P. berghei-Parasiten. Zu diesem Zweck wird kryokonserviertes P. berghei-in.......

Die Bestimmung der Häufigkeit und Entwicklung von Schizonten ist entscheidend, um sicherzustellen, dass sich genügend lebensfähige Parasiten im optimalen Stadium für die Transfektion befinden. Unreife Schizonten können von voll ausgereiften Schizonten durch das Vorhandensein von weniger Merozoiten unterschieden werden, die nicht den gesamten intrazellulären Raum des Erythrozyten ausfüllen (Abbildung 1B). Es ist wichtig zu beachten, dass bei der Herstellung von Blutausstrichen aus kult.......

Wir haben das obige Protokoll in unserem Labor verwendet, um mehrere Linien transgener P. berghei-Parasiten zu erzeugen. Obwohl dieses Protokoll für P. berghei optimiert ist, haben wir dieses Protokoll auch erfolgreich zur Generierung transgener P. yoelii-Sporozoite verwendet . Nach Injektion der transfizierten Schizonten in Mäuse sind die Parasiten in der Regel spätestens nach 3 d.p.i. in allen Gruppen nachweisbar, einschließlich der Kontrolle ohne Plasmid. Mit der Selektion wird erst bego.......

Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss der National Institutes of Health AI168307 an SPK unterstützt.  Wir danken dem UGA CTEGD Durchflusszytometrie-Kern und dem UGA CTEGD-Mikroskopie-Kern. Wir danken auch den Beiträgen von Ash Pathak, Anne Elliot und den Mitarbeitern von UGA Sporocore bei der Optimierung des Protokolls. Wir danken Dr. Daichi Kamiyama für wertvolle Einblicke, Diskussionen und die Elternplasmide, die GFP₁₁ und GFP _1-10 enthalten. Wir möchten uns auch bei den Mitgliedern des Kurup-Labors für ihre ständige Unterstützung, Geduld und Ermutigung bedanken.