Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
מלריה מועברת באמצעות חיסון של שלב sporozoite של פלסמודיום על ידי יתושים נגועים. פלסמודיום מהונדס איפשר לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה של המלריה ותרם ישירות למאמצי פיתוח החיסון למלריה. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה יעילה ליצירת פלסמודיום ברגהיי sporozoites מהונדס.
מלריה היא מחלה קטלנית הנגרמת על ידי הטפיל פלסמודיום ומועברת באמצעות עקיצה של יתושי אנופלס נקביים. שלב הספורוזואיטים של פלסמודיום המושקע על ידי יתושים בעורם של פונדקאים בעלי חוליות עובר שלב של התפתחות חובה בכבד לפני תחילת המלריה הקלינית. אנו יודעים מעט מאוד על הביולוגיה של התפתחות פלסמודיום בכבד; הגישה לשלב הספורוזואיטים והיכולת לשנות גנטית ספורוזואיטים כאלה הם כלים קריטיים לחקר טבעו של זיהום פלסמודיום והתגובה החיסונית הנובעת מכך בכבד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף ליצירת פלסמודיום ברגהיי sporozoites מהונדס. אנו משנים גנטית את שלב הדם P. berghei ומשתמשים בצורה זו כדי להדביק יתושי אנופלס כאשר הם לוקחים ארוחת דם. לאחר שהטפילים הטרנסגניים עוברים התפתחות אצל היתושים, אנו מבודדים את שלב הספורוזואיטים של הטפיל מבלוטות הרוק של היתושים לצורך ניסויים in vivo ו-in vitro . אנו מדגימים את תקפות הפרוטוקול על ידי יצירת ספורוזואיטים של זן חדש של P. berghei המבטא את תת-היחידה 11 של החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) (GFP11), ומראים כיצד ניתן להשתמש בו כדי לחקור את הביולוגיה של מלריה בשלב הכבד.
למרות ההתקדמות בפיתוח תרופות ובמחקר למניעה וטיפול במלריה, נטל התחלואה העולמי של המלריה נותר גבוה. יותר מחצי מיליון בני אדם מתים ממלריה מדי שנה, כאשר רמות התמותה הגבוהות ביותר נצפו בקרב ילדים החיים באזורים אנדמיים למלריה, כגון אפריקה שמדרום לסהרה1. מלריה נגרמת על ידי הטפיל פלסמודיום, המועבר לבני אדם באמצעות עקיצה של יתושי אנופלס נקביים הנושאים את הטפיל בבלוטות הרוק שלהם. השלב הזיהומי של פלסמודיום - הספורוזואיטים - מופקדים בעורם של המארחים בעלי החוליות במהלך ארוחת דם ונוסעים דרך זרם הדם כדי להדביק תאי כבד, שם הם עוברים התפתחות חובה (המהווה מלריה טרום אריתרוציטים) לפני הדבקת אריתרוציטים. זיהום של אר....
כל המחקר שכלל בעלי חוליות במעבדה שלנו בוצע בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים של אוניברסיטת ג'ורג'יה לשימוש בבעלי חיים.
1. דור של P . berghei - עכברים נגועים
קביעת התדירות וההתפתחות של סכיזונטים היא קריטית כדי להבטיח כי מספיק טפילים קיימא נמצאים בשלב האופטימלי עבור transfection. סכיזונטים לא בוגרים יכולים להיות מובחנים מסכיזונטים בוגרים לחלוטין על-ידי נוכחות של פחות מרוזואיטים שאינם ממלאים את כל החלל התוך-תאי של ה-RBC (איור 1B). חשוב ל?.......
השתמשנו בפרוטוקול הנ"ל במעבדה שלנו כדי ליצור מספר שורות של טפילי P. berghei טרנסגניים. למרות אופטימיזציה עבור P. berghei, השתמשנו בהצלחה פרוטוקול זה כדי ליצור P. yoelii sporozoites טרנסגני. לאחר הזרקת סכיזונטים נגועים לעכברים, טפילים ניתנים לגילוי בדרך כלל לא יאוחר מ 3 d.p.i. בכל הקבוצות, כולל בקר.......
עבודה זו נתמכה על ידי AI168307 המענק של המכונים הלאומיים לבריאות ל- SPK. אנו מודים לליבת הציטומטריה של זרימה UGA CTEGD ולליבת המיקרוסקופ UGA CTEGD. אנו מכירים גם בתרומתם של אש פאטאק, אן אליוט והצוות של UGA Sporocore באופטימיזציה של הפרוטוקול. אנו רוצים להודות לד"ר דאיצ'י קאמיאמה על תובנות חשובות, דיון, ופלסמידים האב המכילים GFP11 ו- GFP 1-10. ברצוננו להודות גם לחברי מעבדת קורופ על התמיכה, הסבלנות והעידוד הבלתי פוסקים.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
Delta Vision II - Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved