Generazione di sporozoiti geneticamente modificati di Plasmodium berghei

La malaria si trasmette attraverso l'inoculazione dello stadio sporozoite di Plasmodium da parte di zanzare infette. Il Plasmodium transgenico ci ha permesso di comprendere meglio la biologia della malaria e ha contribuito direttamente agli sforzi di sviluppo del vaccino contro la malaria. In questo articolo descriviamo una metodologia semplificata per generare sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei .

La malaria è una malattia mortale causata dal parassita Plasmodium e si trasmette attraverso la puntura delle zanzare femmine di zanzara Anopheles . Lo stadio sporozooitico di Plasmodium depositato dalle zanzare nella pelle degli ospiti vertebrati subisce una fase di sviluppo obbligatorio nel fegato prima di iniziare la malaria clinica. Sappiamo poco sulla biologia dello sviluppo del Plasmodium nel fegato; l'accesso allo stadio di sporozoite e la capacità di modificare geneticamente tali sporozoiti sono strumenti fondamentali per studiare la natura dell'infezione da Plasmodium e la conseguente risposta immunitaria nel fegato. Qui presentiamo un protocollo completo per la generazione di sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei . Modifichiamo geneticamente P. berghei allo stadio sanguigno e usiamo questa forma per infettare le zanzare Anopheles quando assumono un pasto di sangue. Dopo che i parassiti transgenici si sono sviluppati nelle zanzare, isoliamo lo stadio di sporozoite del parassita dalle ghiandole salivari della zanzara per la sperimentazione in vivo e in vitro . Dimostriamo la validità del protocollo generando sporozoiti di un nuovo ceppo di P. berghei che esprime la subunità 11 della proteina fluorescente verde (GFP) (GFP₁₁) e mostriamo come potrebbe essere utilizzato per studiare la biologia della malaria allo stadio epatico.

Nonostante i progressi nello sviluppo di farmaci e nella ricerca sulla prevenzione e il trattamento della malaria, il carico globale di malattia della malaria rimane elevato. Oltre mezzo milione di persone muoiono di malaria ogni anno, con i più alti livelli di mortalità osservati tra i bambini che vivono in regioni endemiche per la malaria, come^l'Africa sub-sahariana. La malaria è causata dal parassita Plasmodium, che viene trasmesso all'uomo attraverso la puntura di zanzare Anopheles femmine che portano il parassita nelle loro ghiandole salivari. Lo stadio infettivo del Plasmodium, gli sporozoi....

Tutte le ricerche che hanno coinvolto animali vertebrati nel nostro laboratorio sono state eseguite in conformità con le linee guida e i protocolli per l'uso degli animali dell'Università della Georgia.

1. Generazione di topi infetti da P. berghei

1. Avviare l'infezione allo stadio ematico in topi C57BL/6 (B6) maschi o femmine di 6-8 settimane utilizzando parassiti selvatici di P. berghei. Per fare ciò, trasferire sangue crioconservato infetto da <.......

Determinare la frequenza e lo sviluppo degli schizonti è fondamentale per garantire che un numero sufficiente di parassiti vitali si trovi nella fase ottimale per la trasfezione. Gli schizonti immaturi possono essere differenziati dagli schizonti completamente maturi per la presenza di un minor numero di merozoiti che non riempiono l'intero spazio intracellulare dei globuli rossi (Figura 1B). È importante notare che quando si eseguono strisci di sangue da sangue coltivato, i globuli rossi .......

Abbiamo utilizzato il protocollo di cui sopra nel nostro laboratorio per creare diverse linee di parassiti transgenici P. berghei. Sebbene ottimizzato per P. berghei, abbiamo anche utilizzato con successo questo protocollo per generare sporozoiti transgenici di P. yoelii. Dopo aver iniettato gli schizonti trasfettati nei topi, i parassiti sono rilevabili in genere non più tardi di 3 d.p.i. in tutti i gruppi, compreso il controllo senza plasmidi. La selezione viene avviata solo una volta che la.......

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del National Institutes of Health AI168307 a SPK.  Ringraziamo il nucleo di citometria a flusso UGA CTEGD e il nucleo di microscopia UGA CTEGD. Riconosciamo anche i contributi di Ash Pathak, Anne Elliot e dello staff di UGA Sporocore nell'ottimizzazione del protocollo. Vogliamo ringraziare il Dr. Daichi Kamiyama per le preziose intuizioni, la discussione e i plasmidi genitori contenenti GFP₁₁ e GFP _1-10. Vorremmo anche ringraziare i membri del laboratorio Kurup per il loro costante supporto, pazienza e incoraggiamento.