Generering av genmodifisert Plasmodium berghei Sporozoitter

Malaria overføres gjennom inokulering av sporozoittstadiet av Plasmodium av infiserte mygg. Transgenic Plasmodium har gjort det mulig for oss å forstå malariabiologien bedre og har bidratt direkte til utviklingsarbeidet for malariavaksiner. Her beskriver vi en strømlinjeformet metodikk for å generere transgene Plasmodium berghei sporozoitter.

Malaria er en dødelig sykdom forårsaket av parasitten Plasmodium og overføres gjennom bitt av kvinnelige Anopheles mygg. Sporozoittstadiet av Plasmodium avsatt av mygg i huden på vertebratverter gjennomgår en fase med obligatorisk utvikling i leveren før klinisk malaria initieres. Vi vet lite om biologien bak Plasmodium-utviklingen i leveren; Tilgang til sporozoittstadiet og evnen til genetisk modifisering av slike sporozoitter er kritiske verktøy for å studere arten av Plasmodium-infeksjon og den resulterende immunresponsen i leveren. Her presenterer vi en omfattende protokoll for generering av transgene Plasmodium berghei sporozoitter. Vi genmodifiserer blodstadiet P. berghei og bruker dette skjemaet til å infisere Anopheles-mygg når de tar et blodmåltid. Etter at de transgene parasittene har gjennomgått utvikling i myggene, isolerer vi sporozoittstadiet av parasitten fra myggspyttkjertlene for in vivo og in vitro-eksperimentering . Vi demonstrerer gyldigheten av protokollen ved å generere sporozoitter av en ny stamme av P. berghei som uttrykker det grønne fluorescerende proteinet (GFP) underenhet 11 (GFP₁₁), og viser hvordan det kan brukes til å undersøke biologien til malaria i leverstadiet.

Til tross for fremskritt innen narkotikautvikling og forskning på malariaforebygging og behandling, er den globale sykdomsbyrden av malaria fortsatt høy. Over en halv million mennesker dør av malaria hvert år, med de høyeste nivåene av dødelighet sett blant barn som bor i malaria-endemiske regioner, som Afrika sør for Sahara¹. Malaria er forårsaket av parasitten Plasmodium, som overføres til mennesker gjennom bitt av kvinnelige Anopheles-mygg som bærer parasitten i spyttkjertlene. Det smittsomme stadiet av Plasmodium - sporozoittene - blir avsatt i huden til vertebratvertene under et blodmåltid o....

All forskning som involverer virveldyr i laboratoriet vårt ble utført i samsvar med University of Georgia retningslinjer og protokoller for dyrebruk.

1. Generasjon av P. berghei-infiserte mus

1. Start blodstadiuminfeksjon hos hann eller kvinne, 6-8 uker gamle C57BL/6 (B6) mus ved hjelp av villtype P. berghei-parasitter. For å gjøre dette, overfør kryopreservert P. berghei-infisert blod (2 x 10⁵ infiserte RBC), rekonstituert i .......

Bestemmelse av frekvensen og utviklingen av schizonter er avgjørende for å sikre at nok levedyktige parasitter er i det optimale stadiet for transfeksjon. Umodne schizonter kan differensieres fra fullt modne schizonter ved tilstedeværelsen av færre merozoitter som ikke fyller hele det intracellulære rommet til RBC (figur 1B). Det er viktig å merke seg at ved blodutstryk fra dyrket blod kan infiserte RBC bryte opp, noe som resulterer i observasjon av frie, ekstracellulære merozoitter i.......

Vi har brukt ovennevnte protokoll i vårt laboratorium for å lage flere linjer med transgene P. berghei-parasitter. Selv om den er optimalisert for P. berghei, har vi også med hell brukt denne protokollen til å generere transgene P. yoelii sporozoitter. Etter å ha injisert de transfekterte schizontene i mus, kan parasitter påvises vanligvis senest 3 d.p.i. i alle grupper, inkludert ingen plasmidkontroll. Utvelgelse startes først når parasittemi har blitt oppdaget for å sikre levedyktigh.......

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd AI168307 til SPK.  Vi takker UGA CTEGD Flow Cytometry Core og UGA CTEGD Microscopy Core. Vi anerkjenner også bidragene fra Ash Pathak, Anne Elliot og staben til UGA Sporocore i å optimalisere protokollen. Vi ønsker å takke Dr. Daichi Kamiyama for verdifull innsikt, diskusjon og foreldreplasmidene som inneholder GFP₁₁ og GFP _1-10. Vi vil også takke medlemmer av Kurup-laboratoriet for deres konstante støtte, tålmodighet og oppmuntring.