Генерация генетически модифицированных спорозоитов Plasmodium berghei

Малярия передается инфицированными комарами при инокуляции спорозоитной стадии плазмодия . Трансгенный плазмодий позволил нам лучше понять биологию малярии и внес непосредственный вклад в разработку вакцины против малярии. В данной статье мы опишем оптимизированную методологию получения трансгенных спорозоитов Plasmodium berghei .

Малярия является смертельным заболеванием, вызываемым паразитом Plasmodium и передающимся через укусы самок комаров рода Anopheles . Спорозоитная стадия плазмодия , откладываемого комарами в коже позвоночных хозяев, проходит фазу обязательного развития в печени, прежде чем начать клиническую малярию. Мы мало знаем о биологии развития плазмодия в печени; доступ к стадии спорозоита и способность генетически модифицировать такие спорозоиты являются важнейшими инструментами для изучения природы инфекции Plasmodium и результирующего иммунного ответа в печени. Здесь мы представляем комплексный протокол генерации трансгенных спорозоитов Plasmodium berghei . Мы генетически модифицируем P. berghei в крови и используем эту форму для заражения комаров рода Anopheles , когда они едят кровь. После того, как трансгенные паразиты развиваются у комаров, мы выделяем спорозоитную стадию паразита из слюнных желез комаров для экспериментов in vivo и in vitro . Мы демонстрируем валидность протокола, генерируя спорозоиты нового штамма P. berghei , экспрессирующие субъединицу 11 зеленого флуоресцентного белка (GFP₁₁), и показываем, как его можно использовать для исследования биологии малярии на стадии печени.

Несмотря на успехи в разработке лекарств и научных исследованиях в области профилактики и лечения малярии, глобальное бремя малярии остается высоким. Ежегодно от малярии умирает более полумиллиона человек, при этом самые высокие уровни смертности наблюдаются среди детей, живущих в эндемичных по малярии регионах, таких как страны Африки к югу от^{Сахары1}. Малярия вызывается паразитом Plasmodium, который передается человеку через укусы самок комаров рода Anopheles, несущих паразита в своих слюнных железах. Инфекционная стадия плазмодия — спорозоиты — откладываются в коже позвоночных во время трапезы ....

Все исследования с участием позвоночных животных в нашей лаборатории проводились в соответствии с рекомендациями и протоколами Университета Джорджии по использованию животных.

1. Генерация мышей, инфицированных P. berghei

1. Инициируйте инфекцию на стадии .......

Определение частоты и развития шизонтов имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы достаточное количество жизнеспособных паразитов находилось в оптимальной стадии для трансфекции. Незрелые шизонты можно отличить от полностью зрелых по наличию меньшего количества мерозоит?.......

Мы использовали вышеописанный протокол в нашей лаборатории для создания нескольких линий трансгенных паразитов P. berghei. Несмотря на то, что этот протокол оптимизирован для P . berghei, мы также успешно использовали этот протокол для генерации трансгенных спорозоитов P. yoelii. По?.......

Эта работа была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения AI168307 SPK.  Мы благодарим UGA CTEGD Flow Cytometry Core и UGA CTEGD Microscopy Core. Мы также признательны Эшу Патхаку, Энн Эллиот и сотрудникам UGA Sporocore за вклад в оптимизацию протокола. Мы хотим поблагодарить д-ра Дайчи Камияма (Daichi Kamiyama) за ценные идеи, обсуждение и родительские плазмиды, содержащие GFP₁₁ и GFP _1-10. Мы также хотели бы поблагодарить сотрудников лаборатории Kurup за их постоянную поддержку, терпение и ободрение.