Generación de esporozoítos de Plasmodium berghei modificados genéticamente

La malaria se transmite a través de la inoculación de la etapa de esporozoíto de Plasmodium por mosquitos infectados. El Plasmodium transgénico nos ha permitido comprender mejor la biología de la malaria y ha contribuido directamente a los esfuerzos de desarrollo de vacunas contra la malaria. En este trabajo se describe una metodología simplificada para generar esporozoítos transgénicos de Plasmodium berghei .

La malaria es una enfermedad mortal causada por el parásito Plasmodium y se transmite a través de la picadura de mosquitos Anopheles hembra. La etapa de esporozoíto de Plasmodium depositada por los mosquitos en la piel de los huéspedes vertebrados pasa por una fase de desarrollo obligatorio en el hígado antes de iniciar la malaria clínica. Sabemos poco sobre la biología del desarrollo de Plasmodium en el hígado; El acceso a la etapa de esporozoíto y la capacidad de modificar genéticamente dichos esporozoítos son herramientas críticas para estudiar la naturaleza de la infección por Plasmodium y la respuesta inmunitaria resultante en el hígado. Aquí, presentamos un protocolo integral para la generación de esporozoítos transgénicos de Plasmodium berghei . Modificamos genéticamente el estadio sanguíneo de P. berghei y usamos esta forma para infectar a los mosquitos Anopheles cuando se alimentan de sangre. Después de que los parásitos transgénicos experimentan el desarrollo en los mosquitos, aislamos la etapa de esporozoíto del parásito de las glándulas salivales del mosquito para la experimentación in vivo e in vitro . Demostramos la validez del protocolo mediante la generación de esporozoítos de una nueva cepa de P. berghei que expresa la subunidad 11 de la proteína verde fluorescente (GFP) (GFP₁₁), y mostramos cómo podría usarse para investigar la biología de la malaria en etapa hepática.

A pesar de los avances en el desarrollo de medicamentos y la investigación sobre la prevención y el tratamiento del paludismo, la carga mundial de morbilidad del paludismo sigue siendo alta. Más de medio millón de personas mueren de malaria cada año, y los niveles más altos de mortalidad se observan entre los niños que viven en regiones donde la malaria es endémica, como el África subsahariana¹. La malaria es causada por el parásito Plasmodium, que se transmite a los humanos a través de la picadura de mosquitos Anopheles hembra que portan el parásito en sus glándulas salivales. La etapa infecciosa de ....

Todas las investigaciones con animales vertebrados en nuestro laboratorio se realizaron de acuerdo con las pautas y protocolos de uso de animales de la Universidad de Georgia.

1. Generación de ratones infectados por P. berghei

1. Iniciar la infección en la etapa sanguínea en ratones C57BL/6 (B6) machos o hembras de 6 a 8 semanas de edad utilizando parásitos de P. berghei de tipo salvaje. Para ello, se transfiere sangre criopreservada infectada con .......

Determinar la frecuencia y el desarrollo de los esquizontes es fundamental para asegurar que suficientes parásitos viables estén en la etapa óptima para la transfección. Los esquizontes inmaduros se pueden diferenciar de los esquizontes completamente maduros por la presencia de menos merozoítos que no llenan todo el espacio intracelular de los glóbulos rojos (Figura 1B). Es importante tener en cuenta que al hacer frotis de sangre a partir de sangre cultivada, los glóbulos rojos infect.......

Hemos utilizado el protocolo anterior en nuestro laboratorio para crear varias líneas de parásitos transgénicos de P. berghei. Aunque optimizado para P. berghei, también hemos utilizado con éxito este protocolo para generar esporozoítos transgénicos de P. yoelii. Después de inyectar los esquizontes transfectados en ratones, los parásitos son detectables típicamente a más tardar 3 d.p.i. en todos los grupos, incluido el control sin plásmido. La selección se inicia solo una vez que s.......

Este trabajo fue apoyado por la subvención de los Institutos Nacionales de Salud AI168307 a SPK.  Agradecemos al núcleo de citometría de flujo CTEGD de la UGA y al núcleo de microscopía CTEGD de la UGA. También reconocemos las contribuciones de Ash Pathak, Anne Elliot y el personal de UGA Sporocore en la optimización del protocolo. Queremos agradecer al Dr. Daichi Kamiyama por sus valiosas ideas, discusiones y los plásmidos padres que contienen GFP₁₁ y GFP _1-10. También nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Kurup por su constante apoyo, paciencia y aliento.