使用荧光激活细胞核分选的脂肪细胞特异性ATAC-Seq与脂肪组织

我们提出了一种用于转座酶可访问染色质的高通量测序（ATAC-seq）测定的方案，专门针对脂肪细胞，使用细胞核分选，从具有核荧光标记的转基因报告小鼠中分离的脂肪组织。

转座酶可接近染色质的高通量测序 （ATAC-seq） 检测是一种强大的技术，可实现全基因组染色质可及性分析。该技术有助于理解一系列生物过程中基因表达的调控机制。尽管ATAC-seq已针对不同类型的样品进行了修改，但尚未对脂肪组织的ATAC-seq方法进行有效修改。脂肪组织面临的挑战包括复杂的细胞异质性、高脂质含量和高线粒体污染。为了克服这些问题，我们开发了一种协议，通过采用荧光激活的细胞核分选与来自转基因报告基因核标记和翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP）小鼠的脂肪组织，允许脂肪细胞特异性ATAC-seq。该协议以最少的测序读数浪费产生高质量的数据，同时减少了细胞核输入和试剂的数量。本文为ATAC-seq方法提供了详细的分步说明，该方法验证了使用从小鼠脂肪组织中分离的脂肪细胞核。该协议将有助于研究脂肪细胞在各种生物刺激下的染色质动力学，这将允许新的生物学见解。

脂肪组织专门用于以脂质分子的形式储存多余的能量，是代谢调节的关键器官。严格控制脂肪细胞的形成和维持对脂肪组织功能和全身能量稳态至关重要¹.许多转录调节因子在控制脂肪细胞分化、可塑性和功能方面起着关键作用;其中一些调节因子与人类代谢紊乱有关^2，3。用于基因表达和表观基因组分析的高通量测序技术的最新进展进一步促进了脂肪细胞生物学分子调节因子的^发现4。由于脂肪组织的异质性，使用脂肪组织的分子分析研究具有挑战性。脂肪组织主要由负责脂肪储存的脂肪细胞组成，但也包含各种其他细胞类型，如成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞⁵。此外，脂肪组织的细胞组成响应于病理生理变化（例如温度和营养状况）而发生显着改变⁶。为了克服这些问题，我们之前开发了一种转基因报告小鼠，名为核标记和翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP），它以Cre重组酶依赖的方式产生GFP标记的核糖体和mCherry标记的生物素化细胞核⁷。双标记系统使人能够对组织进行细胞类型特异性转录组学和表观基因组学分析。使用NuTRAP小鼠与脂肪细胞特异性脂联素-Cre系（Adipoq-NuTRAP）杂交，我们先前表征了体内纯脂肪细胞群的基因....

动物护理和实验是根据印第安纳大学医学院机构动物护理和使用委员会批准的程序进行的。

1. 实验开始前的准备工作

1. 组织制备
   1. 对于脂肪细胞核标记，将NuTRAP小鼠与脂肪细胞特异性脂联素-Cre系（Adipoq-Cre）杂交以产生Adipoq-NuTRAP小鼠，其对Adipoq-Cre和NuTRAP都是半合的。
   2. 如前所述，从Adipoq-NuTRAP小鼠中解剖感兴趣的脂肪组织¹⁴。

为了使用这种ATAC-seq协议分析脂肪组织，我们生成了喂食食物饮食的Adipoq-NuTRAP小鼠;然后，我们使用流式细胞术从附睾白色脂肪组织（eWAT），腹股沟白色脂肪组织（iWAT）和棕色脂肪组织（BAT）中分离脂肪细胞核。如上所述，分离的细胞核用于标记，然后进行DNA纯化，PCR扩增，质量检查步骤，测序和数据分析。这个代表性实验的目的是分析从不同脂肪库分离的纯脂肪细胞群的染色质可及性。

在本文中，我们提出了一种优化的ATAC-seq协议来评估 体内脂肪细胞特异性染色质的可及性。该ATAC-seq方案使用Adipoq-NuTRAP小鼠成功生成了脂肪细胞特异性染色质可及性图谱。成功和可重复的ATAC-seq实验的最关键因素是细胞核质量。至关重要的是立即将解剖的脂肪组织快速冷冻在液氮中，并将其安全地储存在-80°C下，而无需解冻直至使用。在细胞核分离和分选过程中防止脂肪细胞核损伤也很重?.......

这项工作得到了IUSM Showalter研究信托基金（致H.C.R.），IUSM糖尿病和代谢疾病中心试点和可行性资助（致H.C.R.），国家糖尿病，消化和肾脏疾病研究所（R01DK129289至H.C.R.）和美国糖尿病协会初级教师奖（7-21-JDF-056至H.C.R.）的支持。