Adipocytspecifik ATAC-Seq med fedtvæv ved hjælp af fluorescensaktiveret kernesortering

Vi præsenterer en protokol til assay for transposase-tilgængeligt kromatin med high-throughput sekventering (ATAC-seq) specifikt på adipocytter ved hjælp af kernesortering med fedtvæv isoleret fra transgene reportermus med nuklear fluorescensmærkning.

Assay for transposase-tilgængeligt kromatin med high-throughput sekventering (ATAC-seq) er en robust teknik, der muliggør genom-dækkende kromatintilgængelighedsprofilering. Denne teknik har været nyttig til at forstå reguleringsmekanismerne for genekspression i en række biologiske processer. Selvom ATAC-seq er blevet modificeret til forskellige typer prøver, har der ikke været effektive ændringer af ATAC-seq-metoder til fedtvæv. Udfordringer med fedtvæv omfatter den komplekse cellulære heterogenitet, stort lipidindhold og høj mitokondriel forurening. For at overvinde disse problemer har vi udviklet en protokol, der tillader adipocytspecifik ATAC-seq ved at anvende fluorescensaktiveret kernesortering med fedtvæv fra den transgene reporter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus. Denne protokol producerer data af høj kvalitet med minimal spildt sekventeringslæsning, samtidig med at mængden af kerneinput og reagenser reduceres. Dette papir indeholder detaljerede trinvise instruktioner til ATAC-seq-metoden, der er valideret til brug af adipocytkerner isoleret fra musefedtvæv. Denne protokol vil hjælpe med undersøgelsen af kromatindynamik i adipocytter ved forskellige biologiske stimuleringer, hvilket vil give mulighed for ny biologisk indsigt.

Fedtvæv, der er specialiseret til opbevaring af overskydende energi i form af lipidmolekyler, er et nøgleorgan til metabolisk regulering. Den strenge kontrol af adipocytdannelse og vedligeholdelse er afgørende for fedtvævsfunktion og helkropsenergihomeostase¹. Mange transkriptionelle regulatorer spiller en kritisk rolle i kontrollen af adipocytdifferentiering, plasticitet og funktion; Nogle af disse regulatorer er impliceret i metaboliske lidelser hos mennesker ^2,3. Nylige fremskridt inden for high-throughput sekventeringsteknikker til genekspression og epigenomisk analyse har yderliger....

Dyrepleje og eksperimenter blev udført i henhold til procedurer godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Indiana University School of Medicine.

1. Forberedelser inden forsøget påbegyndes

1. Vævsforberedelse
   1. Til mærkning af adipocytkerner krydses NuTRAP-mus med adipocytspecifikke adiponectin-Cre-linjer (Adipoq-Cre) for at generere Adipoq-NuTRAP-mus, som er hemizygote for både Adipoq-Cre og NuTRAP.
   2. Dissekere fedtvæv af interesse .......

For at analysere fedtvæv ved hjælp af denne ATAC-seq-protokol genererede vi Adipoq-NuTRAP-mus, der blev fodret med chow-diæter; vi isolerede derefter adipocytkerner fra epididymalt hvidt fedtvæv (eWAT), inguinalt hvidt fedtvæv (iWAT) og brunt fedtvæv (BAT) ved hjælp af flowcytometri. De isolerede kerner blev brugt til mærkning efterfulgt af DNA-oprensning, PCR-amplifikation, kvalitetskontroltrin, sekventering og dataanalyse som beskrevet ovenfor. Formålet med dette repræsentative eksperiment var at profilere kr.......

I dette papir har vi præsenteret en optimeret ATAC-seq-protokol til vurdering af adipocytspecifik kromatintilgængelighed in vivo. Denne ATAC-seq-protokol, der bruger Adipoq-NuTRAP-musen, genererede med succes adipocytspecifikke kromatintilgængelighedsprofiler. Den mest kritiske faktor for vellykkede og reproducerbare ATAC-seq-eksperimenter er kernekvaliteten. Det er vigtigt straks at snapfryse det dissekerede fedtvæv i flydende nitrogen og opbevare dem sikkert ved -80 °C uden optøning indtil brug. Det er o.......

Dette arbejde blev støttet af IUSM Showalter Research Trust Fund (til HCR), et IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (til HCR), National Institute of Diabetes og fordøjelses- og nyresygdomme (R01DK129289 til HCR) og American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 til HCR).