Adipocyt-specifieke ATAC-Seq met vetweefsels met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernsortering

We presenteren een protocol voor assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing (ATAC-seq) specifiek op adipocyten met behulp van kernsortering met vetweefsels geïsoleerd uit transgene reportermuizen met nucleaire fluorescentielabeling.

Assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is een robuuste techniek die genoombrede chromatinetoegankelijkheidsprofilering mogelijk maakt. Deze techniek is nuttig geweest voor het begrijpen van de regulerende mechanismen van genexpressie in een reeks biologische processen. Hoewel ATAC-seq is aangepast voor verschillende soorten monsters, zijn er geen effectieve wijzigingen geweest van ATAC-seq-methoden voor vetweefsels. Uitdagingen met vetweefsels zijn de complexe cellulaire heterogeniteit, het grote lipidegehalte en de hoge mitochondriale besmetting. Om deze problemen op te lossen, hebben we een protocol ontwikkeld dat adipocyt-specifieke ATAC-seq mogelijk maakt door gebruik te maken van fluorescentie-geactiveerde kernsortering met vetweefsels van de transgene reporter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) muis. Dit protocol produceert gegevens van hoge kwaliteit met minimale verspilde sequencing-reads, terwijl de hoeveelheid nucleusinvoer en reagentia wordt verminderd. Dit artikel bevat gedetailleerde stapsgewijze instructies voor de ATAC-seq-methode die is gevalideerd voor het gebruik van adipocytkernen geïsoleerd uit vetweefsel van muizen. Dit protocol zal helpen bij het onderzoek naar chromatinedynamica in adipocyten op verschillende biologische stimulaties, wat nieuwe biologische inzichten mogelijk zal maken.

Vetweefsel, dat gespecialiseerd is voor het opslaan van overtollige energie in de vorm van lipidemoleculen, is een belangrijk orgaan voor metabole regulatie. De strikte controle van de vorming en het onderhoud van adipocyten is van vitaal belang voor de vetweefselfunctie en de energiehomeostase van het hele lichaam¹. Veel transcriptionele regulatoren spelen een cruciale rol bij de controle van adipocytendifferentiatie, plasticiteit en functie; Sommige van deze regulatoren zijn betrokken bij metabole stoornissen bij de mens ^2,3. Recente ontwikkelingen in high-throughput sequencingtechnie....

Dierverzorging en experimenten werden uitgevoerd volgens procedures die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Indiana University School of Medicine.

1. Voorbereidingen voor het begin van het experiment

1. Weefselvoorbereiding
   1. Voor het labelen van adipocytenkernen kruist u NuTRAP-muizen met adipocyt-specifieke adiponectine-Cre-lijnen (Adipoq-Cre) om Adipoq-NuTRAP-muizen te genereren, die hemizygoot zijn voor zowel Adipoq-Cre a.......

Om vetweefsel te analyseren met behulp van dit ATAC-seq-protocol, genereerden we Adipoq-NuTRAP-muizen die chow-diëten kregen; Vervolgens isoleerden we adipocytkernen uit epididymaal wit vetweefsel (eWAT), inguinaal wit vetweefsel (iWAT) en bruin vetweefsel (BAT) met behulp van flowcytometrie. De geïsoleerde kernen werden gebruikt voor tagmentatie, gevolgd door DNA-zuivering, PCR-amplificatie, kwaliteitscontrolestappen, sequencing en data-analyse, zoals hierboven beschreven. Het doel van dit representatieve experiment w.......

In dit artikel hebben we een geoptimaliseerd ATAC-seq-protocol gepresenteerd om de toegankelijkheid van adipocytspecifiek chromatine in vivo te beoordelen. Dit ATAC-seq-protocol met behulp van de Adipoq-NuTRAP-muis heeft met succes adipocyt-specifieke chromatine-toegankelijkheidsprofielen gegenereerd. De meest kritische factor voor succesvolle en reproduceerbare ATAC-seq experimenten is de kwaliteit van de kern. Het is van cruciaal belang om de ontleedde vetweefsels onmiddellijk in te vriezen in vloeibare stikst.......

Dit werk werd ondersteund door het IUSM Showalter Research Trust Fund (naar H.C.R.), een IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (naar H.C.R.), het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 naar H.C.R.), en de American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 naar H.C.R.).