ATAC-Seq spécifique aux adipocytes avec tissus adipeux par tri des noyaux activés par fluorescence

Nous présentons un protocole de dosage de la chromatine accessible par la transposase avec séquençage à haut débit (ATAC-seq) spécifiquement sur les adipocytes en utilisant le tri des noyaux avec des tissus adipeux isolés de souris rapporteures transgéniques avec marquage par fluorescence nucléaire.

Le dosage de la chromatine accessible par la transposase avec séquençage à haut débit (ATAC-seq) est une technique robuste qui permet un profilage de l’accessibilité de la chromatine à l’échelle du génome. Cette technique a été utile pour comprendre les mécanismes de régulation de l’expression génique dans une gamme de processus biologiques. Bien que l’ATAC-seq ait été modifié pour différents types d’échantillons, il n’y a pas eu de modifications efficaces des méthodes ATAC-seq pour les tissus adipeux. Les défis avec les tissus adipeux comprennent l’hétérogénéité cellulaire complexe, la grande teneur en lipides et la contamination mitochondriale élevée. Pour surmonter ces problèmes, nous avons développé un protocole qui permet le séquençage ATAC spécifique aux adipocytes en utilisant le tri des noyaux activés par fluorescence avec des tissus adipeux de la souris rapporteur transgénique Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Ce protocole produit des données de haute qualité avec un minimum de lectures de séquençage gaspillées tout en réduisant la quantité d’entrée de noyau et de réactifs. Cet article fournit des instructions détaillées étape par étape pour la méthode ATAC-seq validée pour l’utilisation de noyaux adipocytaires isolés à partir de tissus adipeux de souris. Ce protocole aidera à étudier la dynamique de la chromatine dans les adipocytes sur diverses stimulations biologiques, ce qui permettra de nouvelles connaissances biologiques.

Le tissu adipeux, spécialisé dans le stockage de l’excès d’énergie sous forme de molécules lipidiques, est un organe clé pour la régulation métabolique. Le contrôle strict de la formation et du maintien des adipocytes est vital pour la fonction du tissu adipeux et l’homéostasie énergétique du corps entier¹. De nombreux régulateurs transcriptionnels jouent un rôle essentiel dans le contrôle de la différenciation, de la plasticité et de la fonction des adipocytes ; Certains de ces régulateurs sont impliqués dans les troubles métaboliques chez l’homme ^2,3. Les progrès récents dans les tech....

Les soins et l’expérimentation des animaux ont été effectués conformément aux procédures approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la faculté de médecine de l’Université de l’Indiana.

1. Préparatifs avant de commencer l’expérience

1. Préparation des tissus
   1. Pour le marquage du noyau adipocytaire, croisez des souris NuTRAP avec des lignées adiponectine-Cre spécifiques aux adipocytes (Adipoq-Cre) pour g.......

Pour analyser le tissu adipeux à l’aide de ce protocole ATAC-seq, nous avons généré des souris Adipoq-NuTRAP qui ont été nourries avec des régimes chow; nous avons ensuite isolé les noyaux adipocytaires du tissu adipeux blanc épididymaire (eWAT), du tissu adipeux blanc inguinal (iWAT) et du tissu adipeux brun (MTD) en utilisant la cytométrie en flux. Les noyaux isolés ont été utilisés pour le marquage, suivi de la purification de l’ADN, de l’amplification par PCR, des étapes de contrôle de la qualit.......

Dans cet article, nous avons présenté un protocole ATAC-seq optimisé pour évaluer l’accessibilité de la chromatine spécifique des adipocytes in vivo. Ce protocole ATAC-seq utilisant la souris Adipoq-NuTRAP a généré avec succès des profils d’accessibilité de chromatine spécifiques aux adipocytes. Le facteur le plus critique pour le succès et la reproductibilité des expériences ATAC-seq est la qualité du noyau. Il est essentiel de congeler immédiatement les tissus adipeux disséqués dans de l.......

Ce travail a été soutenu par le Fonds fiduciaire de recherche Showalter de l’IUSM (à H.C.R.), une subvention pilote et de faisabilité du Centre IUSM pour le diabète et les maladies métaboliques (à H.C.R.), l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (R01DK129289 à H.C.R.) et le prix du corps professoral junior de l’American Diabetes Association (7-21-JDF-056 à H.C.R.).