Adipozyten-spezifischer ATAC-Seq mit Fettgewebe mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

Wir präsentieren ein Protokoll für den Assay von Transposase-zugänglichem Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ATAC-seq) speziell an Adipozyten mittels Zellkernsortierung mit Fettgewebe, das aus transgenen Reportermäusen mit nukleärer Fluoreszenzmarkierung isoliert wurde.

Der Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatzsequenzierung (ATAC-seq) ist eine robuste Technik, die eine genomweite Profilierung der Chromatinzugänglichkeit ermöglicht. Diese Technik hat sich als nützlich erwiesen, um die regulatorischen Mechanismen der Genexpression in einer Reihe von biologischen Prozessen zu verstehen. Obwohl ATAC-seq für verschiedene Arten von Proben modifiziert wurde, gab es keine wirksamen Modifikationen der ATAC-seq-Methoden für Fettgewebe. Zu den Herausforderungen bei Fettgeweben gehören die komplexe zelluläre Heterogenität, der hohe Lipidgehalt und die hohe mitochondriale Kontamination. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir ein Protokoll entwickelt, das eine Adipozyten-spezifische ATAC-seq ermöglicht, indem wir fluoreszenzaktivierte Zellkernsortierung mit Fettgewebe aus der transgenen Reporter-Nukle-Markierung und der Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP)-Maus verwenden. Dieses Protokoll erzeugt qualitativ hochwertige Daten mit minimaler Verschwendung von Sequenzierungslesevorgängen und reduziert gleichzeitig die Menge an Nukleus-Input und Reagenzien. Dieser Artikel enthält detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die ATAC-seq-Methode, die für die Verwendung von Adipozytenkernen validiert ist, die aus dem Fettgewebe der Maus isoliert wurden. Dieses Protokoll wird bei der Untersuchung der Chromatindynamik in Adipozyten bei verschiedenen biologischen Stimulationen helfen, was neue biologische Erkenntnisse ermöglicht.

Das Fettgewebe, das darauf spezialisiert ist, überschüssige Energie in Form von Lipidmolekülen zu speichern, ist ein Schlüsselorgan für die Stoffwechselregulation. Die strikte Kontrolle der Adipozytenbildung und -erhaltung ist für die Funktion des Fettgewebes und die Energiehomöostase des gesamten Körpers von entscheidender Bedeutung¹. Viele transkriptionelle Regulatoren spielen eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der Differenzierung, Plastizität und Funktion von Adipozyten. Einige dieser Regulatoren sind an Stoffwechselstörungen beim Menschen beteiligt ^2,3. Jüngste Fortschritte ....

Tierpflege und Tierversuche wurden nach Verfahren durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Indiana University School of Medicine genehmigt wurden.

1. Vorbereitungen vor Beginn des Experiments

1. Gewebevorbereitung
   1. Für die Markierung des Adipozytenkerns kreuzen Sie NuTRAP-Mäuse mit Adipozyten-spezifischen Adiponectin-Cre-Linien (Adipoq-Cre), um Adipoq-NuTRAP-Mäuse zu erzeugen, die sowohl für Adipoq-Cre als auch für NuTRAP hemizyg.......

Um Fettgewebe mit diesem ATAC-seq-Protokoll zu analysieren, haben wir Adipoq-NuTRAP-Mäuse generiert, die mit Chow-Diäten gefüttert wurden. Anschließend isolierten wir Adipozytenkerne aus epididymalem weißem Fettgewebe (eWAT), inguinalem weißem Fettgewebe (iWAT) und braunem Fettgewebe (BAT) mittels Durchflusszytometrie. Die isolierten Kerne wurden für die Tagmentierung verwendet, gefolgt von DNA-Aufreinigung, PCR-Amplifikation, Qualitätsprüfungsschritten, Sequenzierung und Datenanalyse, wie oben beschrieben. Das .......

In dieser Arbeit haben wir ein optimiertes ATAC-seq-Protokoll vorgestellt, um die adipozytenspezifische Chromatinzugänglichkeit in vivo zu untersuchen. Dieses ATAC-seq-Protokoll unter Verwendung der Adipoq-NuTRAP-Maus generierte erfolgreich adipozytenspezifische Chromatin-Zugänglichkeitsprofile. Der wichtigste Faktor für erfolgreiche und reproduzierbare ATAC-seq-Experimente ist die Kernqualität. Es ist wichtig, das präparierte Fettgewebe sofort in flüssigem Stickstoff einzufrieren und bis zur Verwendung si.......

Diese Arbeit wurde unterstützt durch den IUSM Showalter Research Trust Fund (an H.C.R.), ein Pilot- und Machbarkeitsstipendium des IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases (an H.C.R.), das National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 an H.C.R.) und den American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 an H.C.R.).