Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Genetics
אנו מציגים פרוטוקול לבדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף בתפוקה גבוהה (ATAC-seq) במיוחד על אדיפוציטים באמצעות מיון גרעין עם רקמות שומן שבודדו מעכברי כתב טרנסגניים עם תיוג פלואורסצנטי גרעיני.
בדיקה עבור כרומטין נגיש טרנספוזאז עם ריצוף תפוקה גבוהה (ATAC-seq) היא טכניקה חזקה המאפשרת פרופיל נגישות כרומטין ברחבי הגנום. טכניקה זו שימושית להבנת מנגנוני הבקרה של ביטוי גנים במגוון תהליכים ביולוגיים. למרות ATAC-seq כבר שונה עבור סוגים שונים של דגימות, לא היו שינויים יעילים של שיטות ATAC-seq עבור רקמות שומן. אתגרים עם רקמות שומן כוללים הטרוגניות תאית מורכבת, תכולת שומנים גדולה וזיהום מיטוכונדריאלי גבוה. כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו פרוטוקול המאפשר ATAC-seq ספציפי לאדיפוציט על ידי שימוש במיון גרעין המופעל על ידי פלואורסצנטיות עם רקמות שומן מעכבר הכתב המהונדס Nuclear Taggging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). פרוטוקול זה מפיק נתונים באיכות גבוהה עם קריאות רצף מבוזבזות מינימליות תוך הפחתת כמות הקלט והריאגנטים של הגרעין. מאמר זה מספק הוראות מפורטות שלב אחר שלב עבור שיטת ATAC-seq שאומתה לשימוש בגרעיני אדיפוציט שבודדו מרקמות שומן עכבר. פרוטוקול זה יסייע בחקירת דינמיקת הכרומטין באדיפוציטים על גירויים ביולוגיים מגוונים, אשר יאפשרו תובנות ביולוגיות חדשות.
רקמת שומן, המתמחה באחסון אנרגיה עודפת בצורה של מולקולות שומנים, היא איבר מפתח לוויסות מטבולי. הבקרה הקפדנית על היווצרות ותחזוקה של אדיפוציטים חיונית לתפקוד רקמת השומן ולהומאוסטזיס אנרגיה של כל הגוף1. רגולטורי שעתוק רבים ממלאים תפקיד קריטי בבקרת התמיינות האדיפוציטים, הפלסטיות והתפקוד; חלק מהרגולטורים הללו מעורבים בהפרעות מטבוליות בבני אדם 2,3. ההתקדמות האחרונה בטכניקות ריצוף בתפוקה גבוהה לביטוי גנים וניתוח אפיגנומי הקלה עוד יותר על גילוי הרגולטורים המולקולריים של ביולוגיה אדיפוציטית4. מחקרי פרופיל מולקולרי המשתמשים ברקמות שומן מאתגרים לביצוע בשל ההטרוגניות של רקמו....
הטיפול והניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי נהלים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה.
1. הכנות לפני תחילת הניסוי
כדי לנתח רקמת שומן באמצעות פרוטוקול ATAC-seq זה, יצרנו עכברי Adipoq-NuTRAP שניזונו מתזונת צ'או; לאחר מכן בודדנו גרעיני אדיפוציט מרקמת השומן הלבן האפידידימלית (eWAT), מרקמת השומן הלבן המפשעה (iWAT) ומרקמת השומן החום (BAT) באמצעות ציטומטריית זרימה. הגרעינים המבודדים שימשו לתיוג, ולאחר מכן לטיהור DNA, הגברת PCR, ש.......
במאמר זה, הצגנו פרוטוקול ATAC-seq ממוטב להערכת נגישות כרומטין ספציפי לאדיפוציט in vivo. פרוטוקול ATAC-seq זה המשתמש בעכבר Adipoq-NuTRAP יצר בהצלחה פרופילי נגישות של כרומטין ספציפיים לאדיפוציט. הגורם הקריטי ביותר לניסויי ATAC-seq מוצלחים וניתנים לשחזור הוא איכות הגרעין. חשוב להקפיא מיד את רקמות השומן המנ.......
עבודה זו נתמכה על ידי IUSM Showalter Research Trust Fund (ל- H.C.R.), מרכז IUSM לסוכרת ומחלות מטבוליות פיילוט ומענק היתכנות (ל- H.C.R.), המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (R01DK129289 ל- H.C.R.), ופרס הפקולטה הצעירה של האגודה האמריקאית לסוכרת (7-21-JDF-056 ל- H.C.R).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Animals | |||
Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
Reagents & Materials | |||
1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
DTT | Sigma | D9779 | |
DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
Instruments | |||
Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio 5 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved