ATAC-seq adipocita-specifico con tessuti adiposi mediante selezione del nucleo attivato dalla fluorescenza

Presentiamo un protocollo per il dosaggio della cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (ATAC-seq) specificamente sugli adipociti utilizzando la selezione del nucleo con tessuti adiposi isolati da topi reporter transgenici con marcatura a fluorescenza nucleare.

Il saggio per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è una tecnica robusta che consente la profilazione dell'accessibilità della cromatina a livello di genoma. Questa tecnica è stata utile per comprendere i meccanismi regolatori dell'espressione genica in una serie di processi biologici. Sebbene ATAC-seq sia stato modificato per diversi tipi di campioni, non ci sono state modifiche efficaci dei metodi ATAC-seq per i tessuti adiposi. Le sfide con i tessuti adiposi includono la complessa eterogeneità cellulare, il grande contenuto lipidico e l'elevata contaminazione mitocondriale. Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato un protocollo che consente l'ATAC-seq adipocyte-specific utilizzando la selezione del nucleo attivata dalla fluorescenza con tessuti adiposi dal topo transgenico reporter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Questo protocollo produce dati di alta qualità con letture di sequenziamento minime sprecate, riducendo al contempo la quantità di input del nucleo e reagenti. Questo articolo fornisce istruzioni dettagliate passo-passo per il metodo ATAC-seq convalidato per l'uso di nuclei di adipociti isolati da tessuti adiposi di topo. Questo protocollo aiuterà nello studio della dinamica della cromatina negli adipociti su diverse stimolazioni biologiche, che consentiranno nuove intuizioni biologiche.

Il tessuto adiposo, specializzato per immagazzinare l'energia in eccesso sotto forma di molecole lipidiche, è un organo chiave per la regolazione metabolica. Lo stretto controllo della formazione e del mantenimento degli adipociti è vitale per la funzione del tessuto adiposo e l'omeostasi energetica di tutto il corpo¹. Molti regolatori trascrizionali svolgono un ruolo critico nel controllo della differenziazione, della plasticità e della funzione degli adipociti; Alcuni di questi regolatori sono implicati nei disordini metabolici nell'uomo ^2,3. I recenti progressi nelle tecniche di sequ....

La cura e la sperimentazione degli animali sono state eseguite secondo procedure approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Indiana University School of Medicine.

1. Preparativi prima di iniziare l'esperimento

1. Preparazione dei tessuti
   1. Per la marcatura del nucleo adipocitario, incrociare topi NuTRAP con linee adiponectina-Cre specifiche per adipociti (Adipoq-Cre) per generare topi Adipoq-NuTRAP, che sono emizigoti sia per Adipoq-Cre che pe.......

Per analizzare il tessuto adiposo utilizzando questo protocollo ATAC-seq, abbiamo generato topi Adipoq-NuTRAP che sono stati alimentati con diete chow; abbiamo quindi isolato i nuclei degli adipociti dal tessuto adiposo bianco epididimo (eWAT), dal tessuto adiposo bianco inguinale (iWAT) e dal tessuto adiposo bruno (BAT) utilizzando la citometria a flusso. I nuclei isolati sono stati utilizzati per la marcatura, seguita dalla purificazione del DNA, dall'amplificazione PCR, dalle fasi di controllo della qualità, dal sequ.......

In questo articolo, abbiamo presentato un protocollo ATAC-seq ottimizzato per valutare l'accessibilità della cromatina adipocita-specifica in vivo. Questo protocollo ATAC-seq che utilizza il mouse Adipoq-NuTRAP ha generato con successo profili di accessibilità della cromatina adipociti-specifici. Il fattore più critico per esperimenti ATAC-seq di successo e riproducibili è la qualità del nucleo. È fondamentale congelare immediatamente i tessuti adiposi sezionati in azoto liquido e conservarli in modo sicur.......

Questo lavoro è stato sostenuto dallo IUSM Showalter Research Trust Fund (a H.C.R.), un centro IUSM per il diabete e le malattie metaboliche Pilot and Feasibility grant (a H.C.R.), il National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 a H.C.R.), e l'American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 a H.C.R.).