蛍光活性化核ソーティングを用いた脂肪組織を用いた脂肪細胞特異的ATAC-Seq

トランスジェニックレポーターマウスから単離された脂肪組織との核ソーティングを使用して、脂肪細胞上で特異的にトランスポザーゼアクセス可能なクロマチン(ATAC-seq)を核蛍光標識でアッセイするためのプロトコルを紹介します。

ハイスループットシーケンシングによるトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイ(ATAC-seq)は、ゲノムワイドなクロマチンアクセシビリティプロファイリングを可能にする堅牢な技術です。この技術は、さまざまな生物学的プロセスにおける遺伝子発現の制御メカニズムを理解するのに役立っています。ATAC-seqはさまざまな種類のサンプルに対して修飾されていますが、脂肪組織に対するATAC-seq法の効果的な修飾はありませんでした。脂肪組織の課題には、複雑な細胞の不均一性、大きな脂質含有量、および高いミトコンドリア汚染が含まれます。これらの問題を克服するために、トランスジェニックレポーターの核タグ付けおよび翻訳リボソームアフィニティー精製(NuTRAP)マウスの脂肪組織との蛍光活性化核ソーティングを使用することにより、脂肪細胞特異的ATAC-seqを可能にするプロトコルを開発しました。このプロトコルは、核入力と試薬の量を減らしながら、無駄なシーケンシングリードを最小限に抑えて高品質のデータを生成します。この論文は、マウス脂肪組織から分離された脂肪細胞核の使用について検証されたATAC-seq法の詳細なステップバイステップの説明を提供します。このプロトコルは、多様な生物学的刺激による脂肪細胞のクロマチン動態の調査に役立ち、新しい生物学的洞察を可能にします。

脂質分子の形で余分なエネルギーを蓄えることに特化した脂肪組織は、代謝調節の重要な器官です。脂肪細胞の形成と維持の厳密な制御は、脂肪組織の機能と全身のエネルギー恒常性に不可欠です¹。多くの転写調節因子は、脂肪細胞の分化、可塑性、および機能の制御において重要な役割を果たします。これらの調節因子のいくつかは、ヒトの代謝障害に関与しています^2,3。遺伝子発現およびエピゲノム解析のためのハイスループットシーケンシング技術の最近の進歩により、脂肪細胞生物学の分子調節因子の発見がさらに促進されました⁴。脂肪組織を用いた分子プロファイリング研究は、これらの組織の不均一性のために実施が困難です。脂肪組織は主に脂肪貯蔵を担う脂肪細胞で構成されていますが、線維芽細胞、内皮細胞、免疫細胞など、他のさまざまな細胞タイプも含まれています⁵。さらに、脂肪組織の細胞組成は、温度や栄養状態などの病態生理学的変化に応じて劇的に変化します⁶。これらの問題を克服するために、私たちは以前に、GFPタグ付きリボソームとmCherryタグ付きビオチン化核をCreリコンビナーゼ依存的に生成するトランスジェニックレポーターマウス「核タグ付けおよび翻訳リボソームアフィニティー精....

動物の世話と実験は、インディアナ大学医学部の施設内動物管理および使用委員会によって承認された手順に従って実施されました。

1.実験開始前の準備

1. ティッシュの準備
   1. 脂肪細胞の核標識のために、NuTRAPマウスを脂肪細胞特異的アディポネクチン-Cre株(Adipoq-Cre)と交配して、Adipoq-CreとNuTRAPの両方で半接合性であるAdipoq-NuTRAPマウスを作製します.......

このATAC-seqプロトコルを使用して脂肪組織を分析するために、飼料を与えられたAdipoq-NuTRAPマウスを生成しました。次に、フローサイトメトリーを用いて精巣上体白色脂肪組織(eWAT)、鼠径白脂肪組織(iWAT)、褐色脂肪組織(BAT)から脂肪細胞核を単離した。単離された核をタグ付けに使用し、続いて上記のようにDNA精製、PCR増幅、品質チェックステップ、シーケンシング、およびデータ分析を行い?.......

この論文では、 in vivoでの脂肪細胞特異的クロマチンアクセシビリティを評価するための最適化されたATAC-seqプロトコルを提示しました。Adipoq-NuTRAPマウスを用いたこのATAC-seqプロトコルは、脂肪細胞特異的クロマチンアクセシビリティプロファイルの生成に成功しました。ATAC-seq実験の成功と再現性の最も重要な要素は、核の品質です。解剖した脂肪組織を液体窒素中で直ちに急速凍結?.......

この研究は、IUSMショーウォルター研究信託基金(H.C.R.)、IUSM糖尿病および代謝性疾患センターのパイロットおよび実現可能性助成金(H.C.R.)、国立糖尿病および消化器および腎臓病研究所(R01DK129289からH.C.R.)、および米国糖尿病学会ジュニアファカルティ賞(7-21-JDF-056からH.C.R.)によって支援されました。