Adipocytt-spesifikk ATAC-Seq med fettvev ved bruk av fluorescensaktivert kjernesortering

Vi presenterer en protokoll for analyse for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering (ATAC-seq) spesifikt på adipocytter ved bruk av kjernesortering med fettvev isolert fra transgene reportermus med kjernefysisk fluorescensmerking.

Analyse for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering (ATAC-seq) er en robust teknikk som muliggjør profilering av kromatintilgjengelighet i hele genomet. Denne teknikken har vært nyttig for å forstå reguleringsmekanismene for genuttrykk i en rekke biologiske prosesser. Selv om ATAC-seq har blitt modifisert for forskjellige typer prøver, har det ikke vært effektive modifikasjoner av ATAC-seq-metoder for fettvev. Utfordringer med fettvev inkluderer kompleks cellulær heterogenitet, stort lipidinnhold og høy mitokondriell forurensning. For å overvinne disse problemene har vi utviklet en protokoll som tillater adipocytt-spesifikk ATAC-seq ved å bruke fluorescensaktivert kjernesortering med fettvev fra den transgene reporteren Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus. Denne protokollen produserer data av høy kvalitet med minimal bortkastet sekvensering av avlesninger samtidig som mengden kjerneinngang og reagenser reduseres. Dette papiret gir detaljerte trinnvise instruksjoner for ATAC-seq-metoden validert for bruk av adipocyttkjerner isolert fra fettvev fra mus. Denne protokollen vil hjelpe til med undersøkelsen av kromatindynamikk i adipocytter ved ulike biologiske stimuleringer, noe som vil muliggjøre ny biologisk innsikt.

Fettvev, som er spesialisert for lagring av overflødig energi i form av lipidmolekyler, er et nøkkelorgan for metabolsk regulering. Den strenge kontrollen av adipocytdannelse og vedlikehold er avgjørende for fettvevsfunksjon og helkroppsenergihomeostase¹. Mange transkripsjonsregulatorer spiller en kritisk rolle i kontrollen av adipocytdifferensiering, plastisitet og funksjon; Noen av disse regulatorene er involvert i metabolske forstyrrelser hos mennesker ^2,3. Nylige fremskritt innen sekvenseringsteknikker med høy gjennomstrømning for genuttrykk og epigenomisk analyse har ytterligere le....

Dyrepleie og eksperimentering ble utført i henhold til prosedyrer godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Indiana University School of Medicine.

1. Forberedelser før forsøket begynner

1. Vev forberedelse
   1. For merking av adipocyttkjerner, kryss NuTRAP-mus med adipocyttspesifikke adiponektin-Cre-linjer (Adipoq-Cre) for å generere Adipoq-NuTRAP-mus, som er hemizygote for både Adipoq-Cre og NuTRAP.
   2. Dissekere fettvevene av interesse .......

For å analysere fettvev ved hjelp av denne ATAC-seq-protokollen, genererte vi Adipoq-NuTRAP-mus som ble matet chow-dietter; Deretter isolerte vi adipocyttkjerner fra epididymalt hvitt fettvev (eWAT), inguinalt hvitt fettvev (iWAT) og brunt fettvev (BAT) ved hjelp av flowcytometri. De isolerte kjernene ble brukt til tagning, etterfulgt av DNA-rensing, PCR-amplifikasjon, kvalitetskontrolltrinn, sekvensering og dataanalyse, som beskrevet ovenfor. Formålet med dette representative eksperimentet var å profilere kromatintil.......

I denne artikkelen har vi presentert en optimalisert ATAC-seq-protokoll for å vurdere adipocyttspesifikk kromatintilgjengelighet in vivo. Denne ATAC-seq-protokollen ved hjelp av Adipoq-NuTRAP-musen genererte vellykket adipocyttspesifikke kromatintilgjengelighetsprofiler. Den mest kritiske faktoren for vellykkede og reproduserbare ATAC-seq-eksperimenter er kjernekvalitet. Det er viktig å knipsefryse de dissekerte fettvevene umiddelbart i flytende nitrogen og oppbevare dem trygt ved -80 °C uten å tine før bru.......

Dette arbeidet ble støttet av IUSM Showalter Research Trust Fund (til HCR), et IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (til HCR), National Institute of Diabetes og fordøyelses- og nyresykdommer (R01DK129289 til HCR), og American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 til HCR).