ATAC-Seq específico de adipócitos com tecido adiposo usando classificação de núcleo ativado por fluorescência

Apresentamos um protocolo para ensaio de cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) especificamente em adipócitos usando classificação nuclear com tecidos adiposos isolados de camundongos repórteres transgênicos com marcação de fluorescência nuclear.

O ensaio para cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) é uma técnica robusta que permite o perfil de acessibilidade da cromatina em todo o genoma. Esta técnica tem sido útil para a compreensão dos mecanismos regulatórios da expressão gênica em uma variedade de processos biológicos. Embora o ATAC-seq tenha sido modificado para diferentes tipos de amostras, não houve modificações efetivas dos métodos ATAC-seq para o tecido adiposo. Os desafios com o tecido adiposo incluem a complexa heterogeneidade celular, grande conteúdo lipídico e alta contaminação mitocondrial. Para superar esses problemas, desenvolvemos um protocolo que permite ATAC-seq específico de adipócitos empregando a classificação de núcleo ativado por fluorescência com tecidos adiposos do camundongo transgênico Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Este protocolo produz dados de alta qualidade com leituras de sequenciamento desperdiçadas mínimas, reduzindo a quantidade de entrada de núcleo e reagentes. Este artigo fornece instruções detalhadas passo a passo para o método ATAC-seq validado para o uso de núcleos de adipócitos isolados de tecidos adiposos de camundongos. Este protocolo auxiliará na investigação da dinâmica da cromatina em adipócitos após diversos estímulos biológicos, o que permitirá novos insights biológicos.

O tecido adiposo, que é especializado para armazenar o excesso de energia na forma de moléculas lipídicas, é um órgão chave para a regulação metabólica. O controle rigoroso da formação e manutenção dos adipócitos é vital para a função do tecido adiposo e para a homeostase energética de todo o corpo¹. Muitos reguladores transcricionais desempenham um papel crítico no controle da diferenciação, plasticidade e função dos adipócitos; Alguns desses reguladores estão implicados em distúrbios metabólicos em humanos ^2,3. Avanços recentes em técnicas de sequenciamento de alto rendimento para exp....

Os cuidados e experimentação com animais foram realizados de acordo com procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Indiana.

1. Preparações antes do início da experiência

1. Preparo de tecidos
   1. Para a marcação do núcleo do adipócito, cruze camundongos NuTRAP com linhagens de adiponectina-Cre específicas de adipócitos (Adipoq-Cre) para gerar camundongos Adipoq-NuTRAP, que s?.......

Para analisar o tecido adiposo usando este protocolo ATAC-seq, geramos camundongos Adipoq-NuTRAP que foram alimentados com dietas de ração; em seguida, foram isolados núcleos de adipócitos do tecido adiposo branco epididimal (eWAT), tecido adiposo branco inguinal (TABi) e tecido adiposo marrom (BAT) por citometria de fluxo. Os núcleos isolados foram utilizados para marcação, seguida de purificação do DNA, amplificação por PCR, etapas de verificação de qualidade, sequenciamento e análise dos dados, conforme .......

Neste artigo, apresentamos um protocolo ATAC-seq otimizado para avaliar a acessibilidade da cromatina específica para adipócitos in vivo. Este protocolo ATAC-seq usando o camundongo Adipoq-NuTRAP gerou com sucesso perfis de acessibilidade à cromatina específica para adipócitos. O fator mais crítico para experimentos ATAC-seq bem-sucedidos e reprodutíveis é a qualidade do núcleo. É fundamental congelar imediatamente os tecidos adiposos dissecados em nitrogênio líquido e armazená-los com segurança a .......

Este trabalho foi apoiado pelo IUSM Showalter Research Trust Fund (para H.C.R.), um IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (para H.C.R.), o National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 to H.C.R.), e o American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 to H.C.R.).