ATAC-Seq específico de adipocitos con tejidos adiposos mediante clasificación de núcleos activados por fluorescencia

Presentamos un protocolo para el ensayo de cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) específicamente en adipocitos utilizando clasificación de núcleos con tejidos adiposos aislados de ratones reporteros transgénicos con marcado de fluorescencia nuclear.

El ensayo para cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) es una técnica robusta que permite la elaboración de perfiles de accesibilidad de cromatina en todo el genoma. Esta técnica ha sido útil para comprender los mecanismos reguladores de la expresión génica en una variedad de procesos biológicos. Aunque ATAC-seq se ha modificado para diferentes tipos de muestras, no ha habido modificaciones efectivas de los métodos ATAC-seq para tejidos adiposos. Los desafíos con los tejidos adiposos incluyen la compleja heterogeneidad celular, el gran contenido de lípidos y la alta contaminación mitocondrial. Para superar estos problemas, hemos desarrollado un protocolo que permite ATAC-seq específico de adipocitos mediante el empleo de la clasificación de núcleos activados por fluorescencia con tejidos adiposos del ratón transgénico reportero Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Este protocolo produce datos de alta calidad con lecturas de secuenciación desperdiciadas mínimas al tiempo que reduce la cantidad de entrada de núcleo y reactivos. Este documento proporciona instrucciones detalladas paso a paso para el método ATAC-seq validado para el uso de núcleos de adipocitos aislados de tejidos adiposos de ratón. Este protocolo ayudará en la investigación de la dinámica de la cromatina en adipocitos sobre diversas estimulaciones biológicas, lo que permitirá nuevos conocimientos biológicos.

El tejido adiposo, que está especializado para almacenar el exceso de energía en forma de moléculas lipídicas, es un órgano clave para la regulación metabólica. El control estricto de la formación y mantenimiento de los adipocitos es vital para la función del tejido adiposo y la homeostasis energética de todo el cuerpo¹. Muchos reguladores transcripcionales desempeñan un papel crítico en el control de la diferenciación, plasticidad y función de los adipocitos; Algunos de estos reguladores están implicados en trastornos metabólicos en humanos ^2,3. Los avances recientes en técnicas de sec....

El cuidado y la experimentación de los animales se realizaron de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana.

1. Preparativos antes de comenzar el experimento

1. Preparación de tejidos
   1. Para el etiquetado del núcleo de los adipocitos, cruce ratones NuTRAP con líneas de adiponectina-Cre específicas de adipocitos (Adipoq-Cre) para generar ratones Adipo.......

Para analizar el tejido adiposo utilizando este protocolo ATAC-seq, generamos ratones Adipoq-NuTRAP que fueron alimentados con dietas de comida; luego aislamos núcleos de adipocitos del tejido adiposo blanco epididimario (eWAT), tejido adiposo blanco inguinal (iWAT) y tejido adiposo marrón (BAT) mediante citometría de flujo. Los núcleos aislados se utilizaron para el marcado, seguido de purificación de ADN, amplificación por PCR, pasos de control de calidad, secuenciación y análisis de datos, como se describió a.......

En este trabajo, hemos presentado un protocolo ATAC-seq optimizado para evaluar la accesibilidad de la cromatina específica de adipocitos in vivo. Este protocolo ATAC-seq que utiliza el ratón Adipoq-NuTRAP generó con éxito perfiles de accesibilidad de cromatina específicos de adipocitos. El factor más crítico para los experimentos ATAC-seq exitosos y reproducibles es la calidad del núcleo. Es fundamental congelar inmediatamente los tejidos adiposos disecados en nitrógeno líquido y almacenarlos de forma.......

Este trabajo fue apoyado por el IUSM Showalter Research Trust Fund (a H.C.R.), una subvención piloto y de viabilidad del Centro IUSM para la diabetes y las enfermedades metabólicas (a H.C.R.), el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (R01DK129289 a H.C.R.), y el Premio de la Facultad Junior de la Asociación Americana de Diabetes (7-21-JDF-056 a H.C.R.).