Adipocytspecifik ATAC-Seq med fettvävnad med fluorescensaktiverad kärnsortering

Vi presenterar ett protokoll för analys för transposastillgängligt kromatin med high-throughput sekvensering (ATAC-seq) specifikt på adipocyter med hjälp av kärnsortering med fettvävnad isolerad från transgena reportermöss med nukleär fluorescensmärkning.

Analys för transposastillgängligt kromatin med sekvensering med hög genomströmning (ATAC-seq) är en robust teknik som möjliggör genomomfattande kromatintillgänglighetsprofilering. Denna teknik har varit användbar för att förstå de reglerande mekanismerna för genuttryck i en rad biologiska processer. Även om ATAC-seq har modifierats för olika typer av prover, har det inte skett några effektiva modifieringar av ATAC-seq-metoder för fettvävnader. Utmaningar med fettvävnader inkluderar den komplexa cellulära heterogeniteten, stort lipidinnehåll och hög mitokondriell förorening. För att övervinna dessa problem har vi utvecklat ett protokoll som tillåter adipocytspecifik ATAC-seq genom att använda fluorescensaktiverad kärnsortering med fettvävnader från den transgena reportern Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus. Detta protokoll producerar högkvalitativa data med minimala bortkastade sekvensläsningar samtidigt som mängden kärninmatning och reagens minskar. Detta dokument innehåller detaljerade steg-för-steg-instruktioner för ATAC-seq-metoden validerad för användning av adipocytkärnor isolerade från musfettvävnader. Detta protokoll kommer att hjälpa till vid undersökning av kromatindynamik i adipocyter vid olika biologiska stimuleringar, vilket möjliggör nya biologiska insikter.

Fettvävnad, som är specialiserad för att lagra överflödig energi i form av lipidmolekyler, är ett nyckelorgan för metabolisk reglering. Den strikta kontrollen av adipocytbildning och underhåll är avgörande för fettvävnadsfunktion och helkroppsenergihomeostas¹. Många transkriptionsregulatorer spelar en kritisk roll i kontrollen av adipocytdifferentiering, plasticitet och funktion; Några av dessa regulatorer är inblandade i metaboliska störningar hos människor ^2,3. De senaste framstegen inom sekvenseringstekniker med hög genomströmning för genuttryck och epigenomisk analys har ytterligare....

Djurvård och experiment utfördes enligt förfaranden som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee of Indiana University School of Medicine.

1. Förberedelser innan experimentet påbörjas

1. Vävnad förberedelse
   1. För märkning av adipocytkärna, korsa NuTRAP-möss med adipocytspecifika adiponektin-Cre-linjer (Adipoq-Cre) för att generera Adipoq-NuTRAP-möss, som är hemizygota för både Adipoq-Cre och NuTRAP.
   2. Dissekera fettvävnade.......

För att analysera fettvävnad med hjälp av detta ATAC-seq-protokoll genererade vi Adipoq-NuTRAP-möss som matades med chow-dieter; vi isolerade sedan adipocytkärnor från epididymal vit fettvävnad (eWAT), inguinal vit fettvävnad (iWAT) och brun fettvävnad (BAT) med hjälp av flödescytometri. De isolerade kärnorna användes för tagmentation, följt av DNA-rening, PCR-amplifiering, kvalitetskontrollsteg, sekvensering och dataanalys, som beskrivits ovan. Syftet med detta representativa experiment var att profilera .......

I detta dokument har vi presenterat ett optimerat ATAC-seq-protokoll för att bedöma adipocytspecifik kromatintillgänglighet in vivo. Detta ATAC-seq-protokoll som använder Adipoq-NuTRAP-musen genererade framgångsrikt adipocytspecifika kromatintillgänglighetsprofiler. Den mest kritiska faktorn för framgångsrika och reproducerbara ATAC-seq-experiment är kärnkvalitet. Det är viktigt att omedelbart snäppfrysa de dissekerade fettvävnaderna i flytande kväve och förvara dem säkert vid −80 °C utan uppt.......

Detta arbete stöddes av IUSM Showalter Research Trust Fund (till H.C.R.), ett IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (till H.C.R.), National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 till H.C.R.) och American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 till H.C.R.).