Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Genetics
Floresan Aktif Çekirdek Ayıklama Kullanarak Yağ Dokuları ile Adiposit-Spesifik ATAC-Seq
Nükleer floresan etiketlemeli transgenik muhabir farelerden izole edilen yağ dokuları ile çekirdek sıralama kullanarak özellikle adipositler üzerinde yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişilebilir kromatin için bir test protokolü sunuyoruz.
Yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişilebilir kromatin için test, genom çapında kromatin erişilebilirlik profillemesini sağlayan sağlam bir tekniktir. Bu teknik, bir dizi biyolojik süreçte gen ekspresyonunun düzenleyici mekanizmalarını anlamak için yararlı olmuştur. ATAC-seq farklı numune tipleri için modifiye edilmiş olmasına rağmen, yağ dokuları için ATAC-seq yöntemlerinin etkili modifikasyonları olmamıştır. Yağ dokuları ile ilgili zorluklar arasında karmaşık hücresel heterojenite, büyük lipit içeriği ve yüksek mitokondriyal kontaminasyon sayılabilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, transgenik muhabir Nuclear etiketleme ve Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) faresinden yağ dokuları ile floresan aktive edilmiş çekirdek sıralama kullanarak adiposit spesifik ATAC-seq sağlayan bir protokol geliştirdik. Bu protokol, çekirdek girişi ve reaktiflerin miktarını azaltırken minimum boşa harcanan sıralama okumalarıyla yüksek kaliteli veriler üretir. Bu yazıda, fare yağ dokularından izole edilen adiposit çekirdeklerinin kullanımı için doğrulanmış ATAC-seq yöntemi için ayrıntılı adım adım talimatlar verilmektedir. Bu protokol, adipositlerdeki kromatin dinamiklerinin çeşitli biyolojik stimülasyonlar üzerinde araştırılmasına yardımcı olacak ve bu da yeni biyolojik anlayışlara izin verecektir.
Fazla enerjiyi lipit molekülleri şeklinde depolamak için uzmanlaşmış olan yağ dokusu, metabolik düzenleme için kilit bir organdır. Adiposit oluşumunun ve bakımının sıkı kontrolü, yağ dokusu fonksiyonu ve tüm vücut enerji homeostazı için hayati öneme sahiptir1. Birçok transkripsiyonel düzenleyici, adiposit farklılaşmasının, plastisitesinin ve fonksiyonunun kontrolünde kritik bir rol oynamaktadır; Bu düzenleyicilerin bazıları insanlarda metabolik bozukluklarla ilişkilidir 2,3. Gen ekspresyonu ve epigenomik analiz için yüksek verimli dizileme tekniklerindeki son gelişmeler, adiposit biyolo....
Hayvan bakımı ve deneyleri, Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan prosedürlere göre gerçekleştirildi.
1. Deneye başlamadan önceki hazırlıklar
- Doku hazırlama
- Adiposit çekirdeği etiketlemesi için, hem Adipoq-Cre hem de NuTRAP için hemizygot olan Adipoq-NuTRAP fareleri üretmek için NuTRAP farelerini adiposit spesifik adiponektin-Cre hatları (Adipoq-Cre) ile çaprazlayın.
Bu ATAC-seq protokolünü kullanarak yağ dokusunu analiz etmek için, chow diyetleriyle beslenen Adipoq-NuTRAP fareleri ürettik; daha sonra epididim beyaz yağ dokusundan (eWAT), inguinal beyaz yağ dokusundan (iWAT) ve kahverengi yağ dokusundan (BAT) akım sitometrisi kullanarak adiposit çekirdeklerini izole ettik. İzole edilen çekirdekler etiketleme için kullanıldı, bunu yukarıda açıklandığı gibi DNA saflaştırma, PCR amplifikasyonu, kalite kontrol adımları, dizileme ve veri analizi izledi. Bu temsili.......
Bu yazıda, adiposit spesifik kromatin erişilebilirliğini in vivo olarak değerlendirmek için optimize edilmiş bir ATAC-seq protokolü sunduk. Adipoq-NuTRAP fareyi kullanan bu ATAC-seq protokolü, adiposite özgü kromatin erişilebilirlik profillerini başarıyla oluşturdu. Başarılı ve tekrarlanabilir ATAC-seq deneyleri için en kritik faktör çekirdek kalitesidir. Disseke edilmiş yağ dokularının sıvı azot içinde derhal yapışıp dondurulması ve kullanıma kadar çözülmeden -80 ° C'de güve.......
Bu çalışma, IUSM Showalter Araştırma Güven Fonu (H.C.R.'ye), bir IUSM Diyabet ve Metabolik Hastalıklar Merkezi Pilot ve Fizibilite hibesi (HCR'ye), Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (R01DK129289'dan H.C.R.'ye) ve Amerikan Diyabet Derneği Genç Fakülte Ödülü (7-21-JDF-056'dan H.C.R.'ye) tarafından desteklenmiştir.
....| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio 5 |
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
- Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
- Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
- Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
- Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
- Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
- Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
- Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved