Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Dette papir beskriver en metode til at skabe sår i epitelet af en levende Clytia hemisphaerica medusa og billedsårheling ved en høj opløsning in vivo. Derudover præsenteres en teknik til at introducere farvestoffer og lægemidler til forstyrrelsessignalprocesser i epitelcellerne og ekstracellulær matrix under sårheling.
Alle dyreorganer, fra hud til øjne til tarm, er dækket af plader af epitelceller, der giver dem mulighed for at opretholde homeostase og samtidig beskytte dem mod infektion. Derfor er det ikke overraskende, at evnen til at reparere epitelsår er kritisk for alle metazoer. Epitelsårheling hos hvirveldyr involverer overlappende processer, herunder inflammatoriske reaktioner, vaskularisering og re-epithelialisering. Regulering af disse processer involverer komplekse interaktioner mellem epitelceller, naboceller og den ekstracellulære matrix (ECM); ECM indeholder strukturelle proteiner, regulatoriske proteiner og aktive små molekyler. Denne kompleksitet sammen med det faktum, at de fleste dyr har uigennemsigtigt væv og utilgængelige ECM'er, gør sårheling vanskelig at studere i levende dyr. Meget arbejde med epitelsårheling udføres derfor i vævskultursystemer med en enkelt epitelcelletype belagt som et monolag på en kunstig matrix. Clytia hemisphaerica (Clytia) giver et unikt og spændende supplement til disse undersøgelser, der gør det muligt at studere epitelsårheling i et intakt dyr med en autentisk ECM. Det ektodermale epitel af Clytia er et enkelt lag af store pladeepitelceller, der tillader billeddannelse med høj opløsning ved hjælp af differentiel interfererende kontrast (DIC) mikroskopi hos levende dyr. Fraværet af migrerende fibroblaster, vaskulatur eller inflammatoriske reaktioner gør det muligt at dissekere de kritiske hændelser i re-epithelialisering in vivo. Helingen af forskellige typer sår kan analyseres, herunder enkeltcellede mikrosår, små og store epitelsår og sår, der beskadiger kældermembranen. Lamellipodia dannelse, pung streng sammentrækning, cellestrækning, og kollektiv cellemigration kan alle observeres i dette system. Desuden kan farmakologiske midler introduceres via ECM for at ændre celle: ECM-interaktioner og cellulære processer in vivo. Dette arbejde viser metoder til at skabe sår i levende Clytia, fange film af helbredelse og sondere helingsmekanismer ved mikroinjektion af reagenser i ECM.
Ark af epitelceller dækker den ydre overflade af alle metazoer, linje indre organer og opdele dyrekroppen i diskrete rum. Epitelet adskiller også den indre krop fra det ydre miljø og beskytter det mod skader og infektion. Derfor var fremkomsten af epitellag en væsentlig del af udviklingen af flercellede dyr, og epitellag ses hos alle dyr fra hvirveldyr til de mest basale metazoer1. Epitelet af nogle organer er et enkelt monolag, såsom i lungeluftsække, blodkar og tarm2 såvel som i epidermis hos hvirvelløse dyr som planaria og cnidarians3. I andre væv, såsom hud4 og hornhinde5 hos hvirveldyr, er epitelet stratificeret, hvilket betyder, at der er flere epitelcellelag2. I alle tilfælde er det mest basale epitellag fastgjort til kældermembranen, et proteinark, der danner et specialiseret område af den ekstracellulære matrix (ECM)6,7,8.
Brud i epitelet skal hurtigt repareres for at genskabe et kontinuerligt epitelark. Skader på epitelet opstår under naturlige processer, såsom afgivelse af epitelceller i tarmen,9,10 og som følge af betændelse eller fysisk traume. Når en enkelt epitelcelle er beskadiget, skal den enten reparere sig selv eller fjernes, så de omgivende celler kan binde sig til hinanden og lukke hullet11,12. I sår, der er større end størrelsen på en enkelt celle, skal epitelceller bevæge sig for at nå hinanden og reparere arket13. Dette kan opnås ved cellespredning, hvis hullerne er små eller kan kræve migration af epitelceller fra kanten af et sår for at lukke sårgabet; Denne sidstnævnte proces kaldes re-epithelialisering14,15. I embryonale væv spredes epitelceller og migrerer for at lukke sår eller trækkes over kløften ved sammentrækning af actomyosinkabler, der dannes mellem cellerne ved sårmargenen i en mekanisme, der ligner en pungstreng16. I mange voksne væv involverer re-epithelialisering migration af sammenhængende celleark, hvor celler opretholder deres kryds med naboceller14,17,18. I andre væv demonteres celle: celleforbindelser, og epitelceller opfører sig mere som mesenkymale celler og bevæger sig på en koordineret, men uafhængig måde ind i sårområdet under re-epithelialisering 14,19,20,21.
Epitelcellebevægelser reguleres af komplekse interaktioner mellem de migrerende celler og mellem cellerne og ECM. Mens der er en enorm mængde eksperimentel litteratur, der behandler mekanismer til såraktivering af epitelceller og efterfølgende migration, er der stadig meget at opdage. For eksempel er det oprindelige signal, der aktiverer epitelceller til at migrere som reaktion på et sår, ikke blevet endeligt identificeret 22, og det er heller ikke helt forstået, hvordan actin omfordeles for at skabe lamellipodia på siden af epitelceller tættest på såret 22,23,24,25,26,27. Kollektiv cellemigration kræver, at information fra celler ved såret deles med celler, der er distale til såret, og kommunikationsvejen er stadig uklar28. Celle:celle-kryds og celle:ECM-vedhæftede filer skal adskilles og reformeres, efterhånden som cellerne i arket omarrangerer sig selv, men regulering af denne proces forstås dårligt14,29. Fremskridt på disse og andre relaterede spørgsmål er ikke kun vigtigt som et grundlæggende biologisk problem, men også på grund af den kliniske betydning af korrekt sårheling. Sygdomme, der kompromitterer epitelcellernes evne til at migrere korrekt, resulterer i kroniske sår; et eksempel er den genetiske sygdom epidermolysis bullosa, hvor gener, der er involveret i fastgørelsen af epitelcellerne til ECM, muteres, hvilket resulterer i skrøbelig hud, der skræller og blærer. Re-epithelialisering er også kompromitteret i naturligt aldrende væv30,31. En bedre forståelse er derfor afgørende for at udvikle interventioner til forbedring af sårhelingsresultater.
Epitelcellemigration i sårheling er blevet undersøgt ved hjælp af både in vitro-tilgange og modelorganismer. De fleste undersøgelser af sårheling og mekanismer for cellemigration er udført i vævskultur, hvor monolag af en enkelt epitelcelletype dyrkes på et substrat, der erstatter ECM. Cellemonolag er enten ridset eller dyrket med stencils for at skabe huller i bestemte former og størrelser og observeres derefter32,33,34. In vitro-modellen muliggør en ideel visualisering af celleadfærd samt muligheden for at ændre substratets kvaliteter, udsætte celler for lægemidler og abiotiske og biotiske faktorer og transfektere celler med konstruktioner, der udtrykker eller undertrykker forskellige gener af interesse. Imidlertid kan denne reduktionistiske tilgang muligvis ikke fange nogle af de vigtige parametre, der er involveret i epitelcelleadfærd i en in vivo-sammenhæng, herunder kommunikation mellem forskellige celletyper og signalhændelser, der forekommer i ECM11. In vivo-modeller giver den autentiske kontekst af et sår med flere celletyper, overlappende signalveje og en kompleks ECM35. En sådan model for sårhelingsundersøgelser er musen19, hvor nylige fremskridt har gjort det muligt for forskere at observere epidermale celler under heling af sår i fuld tykkelse hos levende dyr36. Musen og andre in vivo-systemer giver dog udfordringer med at studere re-epithelialisering. For det første opvejes den store fordel ved at observere celleadfærd i en naturlig sammenhæng af kompleksiteten af de tidsmæssigt overlappende begivenheder, der opstår under sårheling af hvirveldyr, herunder blodkoagulation, rekruttering af immunceller og betændelse, rekruttering af fibroblaster og celledifferentiering, revaskularisering og ombygning af ECM. Endvidere gør uigennemsigtige væv billeddannelse vanskelig. Drosophila larven og zebrafisk epidermis systemerne 37,38 har overvundet nogle af disse vanskeligheder på grund af deres relative enkelhed39.
Vores laboratorium introducerede for nylig en ny model til undersøgelse af epitelsårheling: medusa (vandmænd) form af hydrozoan cnidarian Clytia hemisphaerica (Clytia)40. Clytia er en ny modelorganisme med et fuldt sekventeret og kommenteret genom 41, enkeltcelle RNAseq-transkriptom42 og protokoller på plads til genommodifikation (mutagenese og transgenese)43,44,45. Cnidarians er en af de ældste eksisterende slægter, der har epitellag, så forståelse af cnidarian sårheling giver indsigt i de forfædres veje, der sikrede epitelintegritet. For de veje, der er bevaret i hele livets træ, tilbyder Clytia et spændende nyt system til at studere epitelcelledynamik og den funktionelle regulering af sårheling in vivo.
Epitelet, der dækker den øvre overflade af Clytia medusa (exumbrella), er et monolag af gennemsigtige, pladeepitelceller, der er ca. 50 μm brede og 1-2 μm tykke (figur 1). De er knyttet til en ECM kaldet mesoglea - vandmændenes "gelé". Mesoglea er sammensætningsmæssigt ligner ECM, der findes hos andre dyr 46,47,48 inklusive hvirveldyr, har en kældermembran 40 og er fuldstændig gennemsigtig. Epitellaget i Clytia medusa kan let ridses eller såres (se nedenfor). Epithelets og ECM's enkelhed og gennemsigtighed muliggør billeddannelse i høj opløsning af cellerne og deres bevægelser under heling. For nylig karakteriserede Kamran et al. helingen af små sår i Clytia epitelet i detaljer40. Det blev påvist, at heling i Clytia sker gennem lamellipodia-baseret cellecrawling, cellespredning og kollektiv cellemigration samt lukning af pungstreng, der er mere typisk for embryonale systemer (selvom det tidligere er set i voksne dyrestrukturer som hornhinden49). Clytia sårheling er ekstremt hurtig, som det er set i andre systemer, der mangler en inflammatorisk respons40,50. Heling i Clytia exumbrella er helt afhængig af bevægelser af de eksisterende epitelceller - ingen celler formerer sig eller migrerer gennem ECM til sårstedet (supplerende film 1). Alle disse resultater tyder på, at Clytia er et nyttigt modelsystem til at studere epitelsårheling. Faktisk førte den lette billeddannelse af epitelceller i Clytia under sårheling til opdagelsen af, at epitelcellelamellipodier strækker sig og spredes over områder med udsat ECM, så længe der er en intakt kældermembran; Hvis kældermembranen er beskadiget, skifter epitelheling til en pungstrengmekanisme40. Dette var den første demonstration af en mekanisme, der ligger til grund for beslutningen om at lukke ved lamellipodia-baseret crawling versus lukning af pungstreng, hvilket fremhæver vigtigheden af specifikke celle: ECM-interaktioner i heling og observation af celler i deres naturlige kontekst.
Nedenfor beskrives protokoller til oprettelse og billeddannelse af enkeltcellede mikrosår, små sår, der primært lukker ved cellespredning, og store sår, der kræver kollektiv cellemigration for at lukke. Desuden beskrives en protokol for introduktion af små molekyler i ECM og epitelceller, hvilket tillader eksperimentelle forstyrrelser af formodede regulatoriske veje for sårheling.
1. Dyrekultur
2. Såring
Figur 1: Intakt og såret exumbrella epitellag i Clytia medusa. (A) Tegneseriegrafik af Clytia medusa-kroppen. (A') Intakt medusa exumbrella epitel set ovenfra. (B) Tegneserie af encellede mikrosår (røde takkede former) med epitelceller i blåt. (B') Enkeltcellede mikrosår. (C) Tegneserie af et lille epitelsår (rød takket form). (C') Lille epitelsår. (D) Tegneserie af et stort epitelsår (rød takket form). (D') Stort epitelsår. Billeder blev alle opnået ved hjælp af DIC-mikroskopi. Skalastænger i (A'-C'): 50 μm. Skalabjælke i (D'): 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Sår i flere størrelser og en beskadiget kældermembran. Et typisk lille exumbrella epitelsår er vist, med etiketter, der angiver lamellipodier, der dannes fra marginale celler. Derudover ses mikrosår i og mellem epitelceller. Bemærk den lille kældermembranrivning i den øverste del af såret. Film 4 viser heling af dette sår. Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Billeddannelse af epitelsårheling
Figur 3: Oprettelse af et lille sår i exumbrellar epitelet. (A) Skånsom ridser af eksparaplyen med en 200 μL pipettespids for at skabe et lille epitelsår. (B) Placering af dæksedlen er undertiden tilstrækkelig til at skabe små epitelsår. (C) Medusa monteret på et fordybningsobjektglas. (D ) Lille epitelsårbillede uden DIC-optik og (E) med DIC-optik. Vægtstænger: 50 μm Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Bedømmelse
Figur 4: Analyse af sårområdet i små epitelsår. (A ) Eksempel på en lille epitelsårheling over 10 min. (B) Eksempel på en anden epitelsårheling over 21 min. De lilla konturer i A,B er sammenlignelige med målingerne af sårområder ved hjælp af lassoværktøjet i FIJI/ImageJ. (C) Normaliseret reduktion af sårområdet over tid i A. (D) Normaliseret reduktion af sårområdet over tid i B. (E) Gennemsnitlig reduktion af sårområdet over tid for 14 små sår. n = 14. Fejlbjælker centreret omkring gennemsnitlig ± SEM. Skalabjælker: 50 μm Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Mesogleal injektioner
Figur 5: Injektionsopsætning til introduktion af farvestoffer eller lægemidler til ECM. (A) Opsætning af injektion. (B) Nærbillede af injektionsopstillingen, der viser mikroinjektionskanylens retning (ca. 45° vinkel i forhold til dyret i skålen). (C) Nærbillede af silikoneinjektionsskålen med medusa i en lille mængde ASW til injektion. (D) En mikroinjektionsnål fyldt med Fast Green FCF, der kommer ind i medusas mesoglea gennem underparaplyen. E) Efter injektion af Fast Green FCF i monteret medusa. Klik her for at se en større version af denne figur.
Efter protokollerne ovenfor blev enkeltcellede mikrosår, små sår og store sår afbildet. Registrerede stakke af billedfiler blev gemt som .avi filer.
I film 1 kan mikrosår ses at lukke mellem og inden i celler (figur 1 og figur 2). Små lamellipodier observeres under lukning efterfulgt af sammentrækning og heling. Affald er udelukket og frigivet i vandet. Healing er afsluttet på et minut eller mindre.
I film 2 og 3 heler små sår af forskellig form gennem dannelse af lamellipodia, forlængelse af lamellipodielle kontakter og spredning af celler ved sårmargenen, som tidligere beskrevet40 (figur 1 og figur 2). Celler i niveauer bag de marginale celler deltager ikke i heling af sår af denne størrelse, og der er heller ikke kollektiv cellemigration. Hurtig og progressiv lukning af epitelhuller efterfølges af vævskontraktion langs den nydannede sårsøm40. Den normaliserede helingshastighed for disse to sår, udtrykt som en procentdel af det oprindelige område over tid, er vist (figur 4C, D). Mens der er en vis variation i dynamikken i sårlukning, giver gennemsnittet af den procentvise områdelukning over tid for 14 sår i forskellige former fra 0,02-0,125 mm2 mulighed for at etablere en gennemsnitskurve for sårheling hos ubehandlede dyr (figur 4E).
Skader på kældermembranen kan tydeligt ses, når de opstår (figur 2). I film 4 spredes celler i margenen af et lille sår, hvor der er kældermembranskader, rundt om det beskadigede område, og mellemrumslukning afsluttes med en sammentrækning af pungstrengen.
Hvis vævet er dehydreret eller for beskadiget til at reparere, kan cellebevægelser stoppe, eller hele cellearket kan briste (film 5 og film 6). Dette sker normalt efter lange perioder med billeddannelse (45 minutter eller længere). Hvis cellesprængning sker tidligt i billeddannelsen, kasseres prøven.
Som vist i film 7 heler store sår i flere faser. For det første bliver kanten af såret glat og regelmæssigt på grund af sammentrækninger i margenen, som tidligere rapporteret57. Derefter ses lamellipodia at dannes fra cellerne ved sårmargenen, hvor lamellipodia bevæger sig fremad for at maksimere kontakten med tilstødende lamellipodia. Sporing af kernerne i celler ved sårmargenen og flere niveauer bag marginalcellerne viser, at store huller tæt ved kollektiv cellemigration40. Celler løsner sig aldrig, men bevæger sig sammen som et ark.
Indførelsen af farvestoffer og farmakologiske midler kan være et kraftfuldt værktøj til dissekering af biologiske mekanismer. Mange stoffer er udelukket fra Clytia (ikke vist), sandsynligvis på grund af slimlaget, der dækker dyrets overflade. Imidlertid kan mikroinjektion bruges til direkte at introducere molekyler i ECM, forstyrre ECM-strukturen eller forstyrre regulerende aktiviteter i ECM. Derudover er farvestoffer og andre molekyler i stand til at komme ind i epitelceller fra basalsiden. Figur 6 viser f.eks. nuklear farvning med Hoechst, membranfarvning med FM1-43 og hæmning af dannelsen af lamellipodia ved cytochalasin B, efter at disse reagenser er mikroinjiceret i ECM. Indførelsen af disse molekyler til ECM og epitelceller før sår tillader eksperimenter, der tester effekten af farmakologiske værktøjer på helingsprocessen.
Figur 6: Medusaens epitelceller efter mikroinjektion af farvestoffer eller farmakologiske midler. (A) Epitelceller vist i toppanel 5 min efter injektion med 20 μM Hoechst (kerner) og 50 μM FM1-43 (membraner). (B,C) Sårheling efter injektion med 1:1.000 DMSO kontrol (B) eller 100 μM cytochalasin B (C). Sår blev lavet 15 minutter efter injektion. Billeder blev taget 5 minutter efter såret. Dannelsen af lamellipodia hæmmes af cytochalasin B. De tilsyneladende "fibre", der ofte ses mellem celler i sårområdet, menes at være resultatet af spændinger, der strækker kældermembranen - de pletter ikke med phalloidin (ikke vist). Skalabjælker: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Film 1: Time-lapse film af enkeltcelle mikrosårheling. Forløbet tid: 20 sek. Billedhastighed: 10 fps. Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at downloade denne film.
Film 2: Time-lapse film om en lille epitelsårheling. Forløbet tid: 9 min 54 s. Billedhastighed: 10 fps. Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at downloade denne film.
Film 3: Time-lapse film af en lille epitelsårheling. Dette sår er større og mere uregelmæssigt formet end såret i film 2. Forløbet tid: 20 min 54 s. Billedhastighed: 10 fps. Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at downloade denne film.
Film 4: Time-lapse film om et lille sår og et mikrosår, der heler med en kældermembranrivning. Lamellipodia spredes rundt om kældermembranrivningen, selvom de kan gå videre over resten af ECM. Når sårets område med kældermembranskaden er omgivet, trækker en pungstrengkontraktion celler over regionen. Forløbet tid: 19 min 4 sek. Billedhastighed: 10 fps. Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at downloade denne film.
Film 5: Celler, der dør i et lille epitelsår. Celledød skyldes sandsynligvis dehydrering af dyret. Forløbet tid: 4 min 24 s. Billedhastighed: 10 fps. Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at downloade denne film.
Film 6: Et lille epitelsår heler ikke helt. Forløbet tid: 42 min 32 s. Billedhastighed: 10 fps. Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at downloade denne film.
Film 7: Stor epitelsårheling. Forløbet tid: 25 min 29 s. Billedhastighed: 10 fps. Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at downloade denne film.
Supplerende figur 1: Skemaer for Clytia-tankdimensioner. 3D visualisering af de specialfremstillede Clytia tanke. (A) Set forfra og bagfra. (B) Set fra siden. Udskæringen i stykket vist i grønt er dækket af nylonnet. Vand kommer ind i tanken direkte over masken, fejer over masken og skaber en cirkulær strøm. Vand kommer ud af systemet gennem hullet i endestykket vist med blåt. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende film 1: Acellulær ekstracellulær matrix i Clytia. Z-stak af Clytia taget ved hjælp af konfokal mikroskopi. Stakken fokuserer oprindeligt på exumbrella og scanner derefter hver 10 μm gennem ECM til pladeendoderm og underparaply. Billeder med DIC (venstre) og Hoechsts kernefarvning (højre) viser manglen på celler i ECM. Vægtstang: 100 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Her præsenteres metoden til billeddannelse af sår in vivo i Clytia, en relativt ny invertebratmodelorganisme40,43,58. Der er flere faktorer, der gør dette system til et unikt og kraftfuldt forskningsværktøj, der adskiller sig fra andre modeller, der bruges til at studere sårheling og re-epithelialisering. For det første er monolagepitelet bundet til en gennemsigtig ECM og ligner således in vitro-vævskulturassays (figur 1, figur 2, figur 3, figur 4). Som i in vitro-assays kan celler afbildes i høj opløsning. Men i modsætning til i vævskultur er der et autentisk cellulært miljø og ECM, så sårheling kan ses i sammenhæng med de komplekse signalhændelser, der forekommer hos et levende skadet dyr. For det andet mangler Clytia inflammatoriske reaktioner, migrerende fibroblaster, vaskulatur og blod. Dette gør det muligt at undersøge re-epithelialiseringsprocessen in vivo i fravær af de overlappende hændelser, der forekommer hos mere komplekse voksne dyr under sårheling59. For det tredje er ECM acellulær (supplerende film 1) og stor, hvilket giver nem adgang med en mikroinjektionsnål (figur 5 og figur 6). Ved hjælp af denne tilgang kan forskere teste effekten af farmakologiske reagenser, der forstyrrer ECM-struktur eller signalering på sårheling in vivo. Reagenser kan også indføres i epitelceller, og deres virkninger på in vivo sårheling kan vurderes. For det fjerde er der protokoller, der findes til oprettelse af mutanter og transgene dyr i Clytia-systemet42,43,44,45. In vivo sårheling kan derfor observeres hos dyr med øget/nedsat ekspression af gener af interesse.
Der er flere kritiske trin i denne teknik. For det første, som vist i figur 3, er det nødvendigt at bruge et mikroskop, der er korrekt konfigureret til DIC-mikroskopi, da de flade, gennemsigtige epitelceller er næsten usynlige med standard lysmikroskopi. Det er også vigtigt at udvikle evnen til at såre dyr forsigtigt, så epitelet er beskadiget uden at skære ECM. En tilsvarende blid berøring er nødvendig for mikroinjektion af materialer i ECM, da omfattende skader på dyret under injektion kan kompromittere en efterfølgende analyse af sårheling. Mens der er en indlæringskurve til disse teknikker, har selv begynderstuderende mestret dem hurtigt i Malami-laboratoriet. Faktisk er disse protokoller blevet brugt til at demonstrere cellemigration i bachelorlaboratoriekurser ved University of Chicago.
For optimal billeddannelse er det vigtigt, at dyret ikke bevæger sig, og det valgte sårområde ikke driver ud af synsfeltet. Hvis dyr pulserer, er behandling med Tricaine som beskrevet meget effektiv. Til drifting er det ofte nødvendigt at flytte prøven manuelt. Disse bevægelser kan elimineres fra den endelige film ved hjælp af registreringsfunktionen i FIJI/ImageJ.
En begrænsning ved dette system er, at det ikke er muligt at skabe identiske sår, da sårene varierer i både form og størrelse ved hjælp af de her beskrevne metoder. Derfor kan det være svært at kvantificere den nøjagtige hastighed af sårlukning eller cellemigration. Positionsmarkører såsom kulstofkorn klæber til den udsatte ECM i et såret dyr og kan bruges til at måle hastigheden af kollektiv cellemigration i store sår (ikke vist). For analyse af små sårlukninger, selv med variabel sårstørrelse og -form, er der et begrænset interval af lukningshastigheder blandt sår af denne størrelse (figur 4). Det er derfor muligt kvantitativt at påvise virkningerne af promotoriske eller repressive farmakologiske reagenser.
Mens dette arbejde beskriver karakteriseringen af sårheling ved kun at bruge DIC-mikroskopi, kan de samme tilgange bruges til billedheling ved hjælp af fluorescens eller konfokal mikroskopi. For at hjælpe med dette er protokoller på plads til at generere transgene dyr, hvor forskellige cellulære og ekstracellulære proteiner er fluorescerende mærket. Samtidig billeddannelse med DIC og fluorescens kombineret med forstyrrelse af sårheling ved hjælp af farmakologiske midler eller mutante linjer vil være en stærk tilgang til forståelse af mekanismer, der ligger til grund for sårhelingsprocessen i epitelet.
Intet at afsløre.
E.E.L.L. er støttet af en bevilling fra National Science Foundation PRFB 2011010. Vi vil gerne takke Tsuyoshi Momose og Evelyn Houliston for at hjælpe os med at etablere vores Clytia kolonier, Jean-Baptiste Reynier for indsamling af mikrosårhelingsbilleder, Harry Kyriazes for konstruktion af pseudo-kreisel tanke og Elizabeth Baldo for at opretholde Clytia habitat. Figur 1B blev oprettet med BioRender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
20500 ACE EKE Microscope Fiber Optic Light Source | Kramer Scientific Corporation | ||
AxioCam 506 mono | ZEISS | 426557-0000-000-MA285 | |
Capillary tubes | World Precision Instruments | TW1004 | |
Cytochalasin B | Abcam | ab143482 | |
Depression slides | Amscope | BS-C12 | |
DMR with DIC options and fluorescence halogen lamp | Leica | ||
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521-10G | |
Fast Green FCF | Thermo Scientific | A16520-06 | |
FM1-43 | Biotium | 70022 | Excitation/Emission: 480/598 nm |
Hoechst 33342 | Thermo Scientific | 62249 | Excitation/Emission: 361/497 nm |
imageJ | NIH | ||
Microloader tips (0.5-10 μL /2-20 μL) | Eppendorf | 930001007 | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | 3301R / M3301L | |
Microscope Cover Glass (22X40-1.5) | Fisherbrand | 12-544-BP | |
Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB085713A | |
PicoNozzle v2 | World Precision Instruments | 5430-ALL | |
Pipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | PV820 | |
Polycarbonate vacuum, desiccator | Bel-art | F42025-0000 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
STEMI Sv11 Dissection scope | ZEISS | STEMI SV11 | |
SYLGARD 184 | Dow Silicones | 1024001 | |
Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
Z-Hab mini system | Pentair | ||
ZEN Microscopy software | Zeiss |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved