Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Dit artikel beschrijft een methode om wonden te creëren in het epitheel van een levende Clytia hemisphaerica medusa en wondgenezing in beeld te brengen met een hoge resolutie in vivo. Daarnaast wordt een techniek gepresenteerd om kleurstoffen en medicijnen te introduceren om signaalprocessen in de epitheelcellen en extracellulaire matrix tijdens wondgenezing te verstoren.
Alle dierlijke organen, van de huid tot ogen tot darmen, zijn bedekt met vellen epitheelcellen waarmee ze homeostase kunnen behouden en tegelijkertijd worden beschermd tegen infecties. Daarom is het niet verwonderlijk dat het vermogen om epitheliale wonden te herstellen van cruciaal belang is voor alle metazoën. Epitheliale wondgenezing bij gewervelde dieren omvat overlappende processen, waaronder ontstekingsreacties, vascularisatie en re-epithelisatie. Regulatie van deze processen omvat complexe interacties tussen epitheelcellen, naburige cellen en de extracellulaire matrix (ECM); de ECM bevat structurele eiwitten, regulerende eiwitten en actieve kleine moleculen. Deze complexiteit, samen met het feit dat de meeste dieren ondoorzichtige weefsels en ontoegankelijke ECM's hebben, maakt wondgenezing moeilijk te bestuderen bij levende dieren. Veel werk aan epitheliale wondgenezing wordt daarom uitgevoerd in weefselkweeksystemen, met een enkel epitheelceltype dat als een monolaag op een kunstmatige matrix is geplateerd. Clytia hemisphaerica (Clytia) biedt een unieke en opwindende aanvulling op deze studies, waardoor epitheliale wondgenezing kan worden bestudeerd in een intact dier met een authentieke ECM. Het ectodermale epitheel van Clytia is een enkele laag van grote plaveiselepitheelcellen, waardoor beeldvorming met hoge resolutie mogelijk is met behulp van differentiële interfererende contrast (DIC) microscopie bij levende dieren. De afwezigheid van migrerende fibroblasten, vasculatuur of ontstekingsreacties maakt het mogelijk om de kritieke gebeurtenissen bij re-epithelisatie in vivo te ontleden. De genezing van verschillende soorten wonden kan worden geanalyseerd, waaronder eencellige microwounds, kleine en grote epitheelwonden en wonden die het keldermembraan beschadigen. Lamellipodia-vorming, samentrekking van de portemonnee, celrekking en collectieve celmigratie kunnen allemaal in dit systeem worden waargenomen. Bovendien kunnen farmacologische middelen via de ECM worden geïntroduceerd om cel:ECM-interacties en cellulaire processen in vivo te wijzigen. Dit werk toont methoden voor het maken van wonden in levende Clytia, het vastleggen van films van genezing en het onderzoeken van genezingsmechanismen door micro-injecterende reagentia in de ECM.
Vellen epitheelcellen bedekken het externe oppervlak van alle metazoën, bekleden interne organen en verdelen het dierlijke lichaam in afzonderlijke compartimenten. Het epitheel scheidt ook het binnenlichaam van de externe omgeving en beschermt het tegen schade en infectie. Vandaar dat de komst van epitheellagen een essentieel onderdeel was van de evolutie van meercellige dieren, en epitheliale lagen worden gezien bij alle dieren, van gewervelde dieren tot de meest basale metazoën1. Het epitheel van sommige organen is een enkele monolaag, zoals in de longluchtzakken, bloedvaten en darm2, evenals in de opperhuid van ongewervelde dieren zoals planaria en cnidarians3. In andere weefsels, zoals de huid4 en het hoornvlies5 van gewervelde dieren, is het epitheel gestratificeerd, wat betekent dat er meerdere epitheelcellagen2 zijn. In alle gevallen wordt de meest basale epitheellaag op het keldermembraan aangebracht, een eiwitplaat die een gespecialiseerd gebied van de extracellulaire matrix (ECM)6,7,8 vormt.
Breuken in het epitheel moeten snel worden gerepareerd om een doorlopende epitheelplaat te creëren. Schade aan het epitheel treedt op tijdens natuurlijke processen, zoals het afstoten van epitheelcellen in de darm,9,10 en als gevolg van ontsteking of fysiek trauma. Wanneer een enkele epitheelcel beschadigd is, moet deze zichzelf herstellen of worden geëlimineerd om de omliggende cellen in staat te stellen zich aan elkaar te hechten en het gat11,12 te sluiten. In wonden groter dan de grootte van een enkele cel moeten epitheelcellen bewegen om elkaar te bereiken en het blad13 te repareren. Dit kan worden bereikt door celverspreiding als de openingen klein zijn of kan de migratie van epitheelcellen uit de marges van een wond vereisen om de wondspleet te dichten; Dit laatste proces wordt re-epithelisatie14,15 genoemd. In embryonale weefsels verspreiden epitheelcellen zich en migreren ze naar dichte wonden of worden ze over de opening getrokken door de samentrekking van actomyosinekabels die zich vormen tussen de cellen aan de wondrand, in een mechanisme dat lijkt op een portemonneestring16. In veel volwassen weefsels omvat re-epithelisatie de migratie van coherente celvellen, waarbij cellen hun verbindingen met naburige cellen behouden14,17,18. In andere weefsels worden cel-celverbindingen ontmanteld en gedragen epitheelcellen zich meer als mesenchymale cellen, die op een gecoördineerde maar onafhankelijke manier in het wondgebied bewegen tijdens re-epithelisatie 14,19,20,21.
Epitheelcelbewegingen worden gereguleerd door complexe interacties tussen de migrerende cellen en tussen de cellen en de ECM. Hoewel er een enorme hoeveelheid experimentele literatuur is over mechanismen van wondactivering van epitheelcellen en daaropvolgende migratie, moet er nog veel worden ontdekt. Het initiële signaal dat epitheelcellen activeert om te migreren als reactie op een wond is bijvoorbeeld niet definitief geïdentificeerd 22, noch is het volledig begrepen hoe actine opnieuw wordt ingezet om lamellipodia te creëren aan de kant van epitheelcellen die zich het dichtst bij de wond bevinden 22,23,24,25,26,27. Collectieve celmigratie vereist dat informatie van cellen aan de wond wordt gedeeld met cellen die distaal zijn van de wond, en de communicatieroute is nog steeds onduidelijk28. Cel:cel juncties en cel:ECM bijlagen moeten worden gedemonteerd en hervormd als cellen in het blad zichzelf herschikken, maar de regulatie van dit proces is slecht begrepen14,29. Vooruitgang boeken op deze en andere gerelateerde vragen is niet alleen belangrijk als een fundamenteel biologisch probleem, maar ook vanwege de klinische betekenis van correcte wondgenezing. Ziekten die het vermogen van epitheelcellen om correct te migreren in gevaar brengen, resulteren in chronische wonden; een voorbeeld is de genetische ziekte epidermolysis bullosa, waarbij genen die betrokken zijn bij de aanhechting van de epitheelcellen aan de ECM worden gemuteerd, wat resulteert in een kwetsbare huid die schilfert en blaren geeft. Re-epithelisatie is ook gecompromitteerd in natuurlijk verouderende weefsels30,31. Een beter begrip is daarom essentieel voor het ontwikkelen van interventies om de wondgenezingsresultaten te verbeteren.
Epitheelcelmigratie bij wondgenezing is bestudeerd met behulp van zowel in vitro benaderingen als modelorganismen. De meeste studies naar wondgenezing en mechanismen van celmigratie zijn uitgevoerd in weefselkweek, waarbij monolagen van een enkel epitheelceltype worden gekweekt op een substraat dat de ECM vervangt. Celmonolagen worden bekrast of gekweekt met stencils om openingen van specifieke vormen en maten te creëren en vervolgenswaargenomen 32,33,34. Het in vitro model maakt een ideale visualisatie van celgedrag mogelijk, evenals de mogelijkheid om kwaliteiten van het substraat te veranderen, om cellen bloot te stellen aan geneesmiddelen en abiotische en biotische factoren, en om cellen te transfecteren met constructies die verschillende genen van belang uitdrukken of onderdrukken. Deze reductionistische benadering kan er echter niet in slagen om enkele van de belangrijke parameters die betrokken zijn bij het gedrag van epitheelcellen in een in vivo context vast te leggen, waaronder communicatie tussen verschillende celtypen en signaleringsgebeurtenissen die zich voordoen in de ECM11. In vivo modellen bieden de authentieke context van een wond, met meerdere celtypen, overlappende signaalwegen en een complexe ECM35. Een dergelijk model voor wondgenezingsstudies is de muis19, waarin recente ontwikkelingen onderzoekers in staat hebben gesteld epidermale cellen te observeren tijdens de genezing van wonden van volledige dikte bij levende dieren36. De muis en andere in vivo systemen vormen echter uitdagingen om re-epithelisatie te bestuderen. Ten eerste wordt het grote voordeel van het observeren van celgedrag in een natuurlijke context gecompenseerd door de complexiteit van de tijdelijk overlappende gebeurtenissen die optreden tijdens de genezing van gewervelde wonden, waaronder bloedstolling, rekrutering van immuuncellen en ontsteking, rekrutering van fibroblasten en celdedifferentiatie, re-vascularisatie en remodellering van de ECM. Verder maken ondoorzichtige weefsels beeldvorming moeilijk. De Drosophila-larve en zebravis epidermissystemen 37,38 hebben een aantal van deze problemen overwonnen vanwege hun relatieve eenvoud39.
Ons lab introduceerde onlangs een nieuw model voor het bestuderen van epitheliale wondgenezing: de medusa (kwallen) vorm van de hydrozoaire cnidarian Clytia hemisphaerica (Clytia)40. Clytia is een opkomend modelorganisme met een volledig gesequenced en geannoteerd genoom41, eencellig RNAseq-transcriptoom 42 en protocollen voor genoommodificatie (mutagenese en transgenese)43,44,45. Cnidarians zijn een van de oudste bestaande afstammingslijnen met epitheliale lagen, dus het begrijpen van cnidarian wondgenezing biedt inzicht in de voorouderlijke paden die epitheelintegriteit verzekerden. Voor die paden die bewaard zijn gebleven in de boom des levens, biedt Clytia een opwindend nieuw systeem om de epitheelceldynamica en de functionele regulatie van wondgenezing in vivo te bestuderen.
Het epitheel dat het bovenoppervlak van de Clytia medusa (exparaplu) bedekt, is een monolaag van transparante, plaveiselepitheelcellen die ongeveer 50 μm breed en 1-2 μm dik zijn (figuur 1). Ze zijn bevestigd aan een ECM genaamd de mesoglea - de "gelei" van de kwal. De mesoglea is qua samenstelling vergelijkbaar met de ECM die wordt aangetroffen bij andere dieren 46,47,48 inclusief gewervelde dieren, heeft een keldermembraan 40 en is volledig transparant. De epitheellaag in de Clytia medusa kan gemakkelijk worden bekrast of gewond (zie hieronder). De eenvoud en transparantie van het epitheel en ECM maakt hoge resolutie beeldvorming van de cellen en hun bewegingen tijdens genezing mogelijk. Onlangs hebben Kamran et al. de genezing van kleine wonden in het Clytia-epitheel in detail gekarakteriseerd40. Er werd aangetoond dat genezing in Clytia plaatsvindt door lamellipodia-gebaseerde celkruipen, celverspreiding en collectieve celmigratie, evenals portemonnee-stringsluiting die meer typerend is voor embryonale systemen (hoewel eerder gezien in volwassen dierlijke structuren zoals het hoornvlies49). Clytia wondgenezing is extreem snel, zoals is gezien in andere systemen die een ontstekingsreactie missen40,50. Genezing in de Clytia-exumbrella is volledig afhankelijk van bewegingen van de bestaande epitheelcellen - geen cellen prolifereren of migreren door de ECM naar de wondplaats (aanvullende film 1). Al deze bevindingen suggereren dat Clytia een nuttig modelsysteem is om epitheliale wondgenezing te bestuderen. Inderdaad, het gemak van het afbeelden van epitheelcellen in Clytia tijdens wondgenezing leidde tot de ontdekking dat epitheelcellamellipodia zich uitstrekken en verspreiden over gebieden van blootgestelde ECM zolang er een intact keldermembraan is; Als het keldermembraan beschadigd is, schakelt epitheliale genezing over op een portemonneesnaarmechanisme40. Dit was de eerste demonstratie van een mechanisme dat ten grondslag ligt aan de beslissing om te sluiten door lamellipodia-gebaseerde kruipen versus portemonnee string sluiting, wat het belang benadrukt van specifieke cel: ECM-interacties bij genezing en van het observeren van cellen in hun natuurlijke context.
Hieronder worden protocollen beschreven voor het maken en afbeelden van eencellige microwounds, kleine wonden die voornamelijk sluiten door celverspreiding en grote wonden die collectieve celmigratie vereisen om te sluiten. Verder wordt een protocol beschreven voor de introductie van kleine moleculen in de ECM- en epitheelcellen, waardoor experimentele verstoringen van vermeende regulerende routes van wondgenezing mogelijk zijn.
1. Dierlijke cultuur
2. Verwonding
Figuur 1: Intacte en gewonde exparaplu epitheellaag in Clytia medusa. (A) Cartoon afbeelding van de Clytia medusa lichaam. (A') Intact medusa exumbrella epitheel van bovenaf gezien. (B) Cartoon van eencellige microwounds (rode gekartelde vormen) met epitheelcellen in blauw. B') Eencellige microwounds. (C) Cartoon van een kleine epitheliale wond (rode gekartelde vorm). C') Kleine epitheliale wond. (D) Cartoon van een grote epitheliale wond (rode gekartelde vorm). D') Grote epitheliale wond. Beelden werden allemaal verkregen met behulp van DIC-microscopie. Schaalstaven in (A'-C'): 50 μm. Schaalbalk in (D'): 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Meerdere wonden en een beschadigd keldermembraan. Een typische kleine exparalu-epitheelwond wordt getoond, met labels die lamellipodia aangeven die zich vormen uit marginale cellen. Daarnaast worden microwounds in en tussen epitheelcellen gezien. Let op de kleine keldermembraan scheur in het bovenste deel van de wond. Film 4 toont genezing van deze wond. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Beeldvorming van epitheliale wondgenezing
Figuur 3: Het creëren van een kleine wond in het overkoepelende epitheel. (A) Voorzichtig krabben van de exumbrella met een pipetpunt van 200 μL om een kleine epitheliale wond te creëren. (B) Het plaatsen van de dekplaat is soms voldoende om kleine epitheelwonden te creëren. (C) Medusa gemonteerd op een depressieglijbaan. (D ) Klein epitheliaal wondbeeld zonder DIC-optica en (E) met DIC-optiek. Schaalstaven: 50 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Analyse
Figuur 4: Analyse van het wondgebied in kleine epitheelwonden. (A ) Voorbeeld van een kleine epitheliale wondgenezing gedurende 10 min. (B) Voorbeeld van een andere epitheliale wondgenezing gedurende 21 min. De paarse contouren in A,B zijn vergelijkbaar met de metingen van wondgebieden met behulp van het lassogereedschap in FIJI/ImageJ. (C) Genormaliseerde vermindering van het wondgebied in de loop van de tijd in A. (D) Genormaliseerde vermindering van het wondgebied in de loop van de tijd in B. (E) Gemiddelde vermindering van het wondgebied in de loop van de tijd voor 14 kleine wonden. n = 14. Foutbalken gecentreerd rond het gemiddelde ± SEM. Schaalbalken: 50 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Mesogleale injecties
Figuur 5: Injectie-instelling voor het introduceren van kleurstoffen of medicijnen in de ECU. (A) Injectie setup. (B) Close-up van de injectieopstelling met de oriëntatie van de micro-injectienaald (ongeveer 45° hoek ten opzichte van het dier in de schaal). (C) Close-up van de siliconen injectieschaal met de medusa in een kleine hoeveelheid ASW voor injectie. (D) Een microinjectienaald geladen met Fast Green FCF die via de subparaplu de mesoglea van de medusa binnendringt. (E) Na-injectie van Fast Green FCF in een gemonteerde medusa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Volgens de bovenstaande protocollen werden eencellige microwounds, kleine wonden en grote wonden in beeld gebracht. Geregistreerde stapels afbeeldingsbestanden werden opgeslagen als .avi bestanden.
In film 1 is te zien dat microwounds zich sluiten tussen en in cellen (figuur 1 en figuur 2). Kleine lamellipodia worden waargenomen tijdens de sluiting, gevolgd door samentrekking en genezing. Puin wordt uitgesloten en in het water geloosd. Genezing is voltooid in een minuut of minder.
In film 2 en 3 genezen kleine wonden van verschillende vormen door de vorming van lamellipodia, uitbreiding van lamellipodiale contacten en verspreiding van cellen aan de wondrand, zoals eerder beschreven40 (figuur 1 en figuur 2). Cellen in lagen achter de marginale cellen nemen niet deel aan de genezing van wonden van deze grootte en er is ook geen sprake van collectieve celmigratie. Snelle en progressieve sluiting van epitheliale openingen wordt gevolgd door weefselcontractie langs de nieuw gevormde wondnaad40. De genormaliseerde genezingssnelheid van deze twee wonden, uitgedrukt als een percentage van het oorspronkelijke gebied in de loop van de tijd, wordt weergegeven (figuur 4C, D). Hoewel er enige variabiliteit is in de dynamiek van wondsluiting, maakt het gemiddelde van het percentage gebiedssluiting in de loop van de tijd voor 14 wonden van verschillende vormen, variërend van 0,02-0,125 mm2 , het mogelijk om een gemiddelde curve voor wondgenezing bij onbehandelde dieren vast te stellen (figuur 4E).
Schade aan het keldermembraan is duidelijk te zien wanneer deze optreedt (figuur 2). In film 4 verspreiden cellen aan de rand van een kleine wond waarin zich schade aan het keldermembraan bevindt zich rond het beschadigde gebied en wordt het sluiten van de opening voltooid met een samentrekking van de portemonnee.
Als het weefsel uitgedroogd of te beschadigd is om te herstellen, kunnen celbewegingen stoppen of kan het hele vel cellen barsten (film 5 en film 6). Dit gebeurt meestal na lange perioden van beeldvorming (45 minuten of langer). Als celuitbarstingen vroeg in de beeldvorming optreden, wordt het monster weggegooid.
Zoals te zien is in film 7, genezen grote wonden in verschillende fasen. Ten eerste wordt de rand van de wond glad en regelmatig door samentrekkingen aan de rand, zoals eerder gemeld57. Vervolgens worden lamellipodia gezien om zich te vormen uit de cellen aan de wondrand, waarbij lamellipodia naar voren bewegen om het contact met aangrenzende lamellipodia te maximaliseren. Het volgen van de kernen in cellen aan de wondrand en verschillende lagen achter de marginale cellen laat zien dat grote gaten dicht raken door collectieve celmigratie40. Cellen komen nooit los, maar bewegen samen als een vel.
De introductie van kleurstoffen en farmacologische middelen kan een krachtig hulpmiddel zijn voor het ontleden van biologische mechanismen. Veel stoffen zijn uitgesloten van Clytia (niet getoond), waarschijnlijk vanwege de slijmlaag die het oppervlak van het dier bedekt. Micro-injectie kan echter worden gebruikt om moleculen rechtstreeks in de ECU te introduceren, waardoor de ECM-structuur wordt verstoord of regulerende activiteiten in de ECU worden verstoord. Bovendien kunnen kleurstoffen en andere moleculen epitheelcellen binnendringen vanaf de basale kant. Figuur 6 toont bijvoorbeeld nucleaire kleuring met Hoechst, membraankleuring met FM1-43 en remming van lamellipodiavorming door cytochalasine B nadat deze reagentia in de ECU zijn geïnjecteerd. De introductie van deze moleculen in de ECM en epitheelcellen vóór verwonding maakt experimenten mogelijk die het effect van farmacologische hulpmiddelen op het genezingsproces testen.
Figuur 6: Epitheelcellen van de medusa na micro-injectie van kleurstoffen of farmacologische middelen. (A) Epitheelcellen getoond in het bovenste paneel 5 min na injectie met 20 μM Hoechst (kernen) en 50 μM FM1-43 (membranen). (B,C) Wondgenezing na injectie met 1:1.000 DMSO controle (B) of 100 μM Cytochalasine B (C). Wonden werden 15 minuten na injectie gemaakt. De foto's werden 5 minuten na de verwonding gemaakt. De vorming van lamellipodia wordt geremd door cytochalasine B. De schijnbare "vezels" die vaak tussen cellen in het wondgebied worden gezien, worden verondersteld het resultaat te zijn van spanning die het keldermembraan uitrekt - ze vlekken niet met falloidine (niet getoond). Schaalstaven: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1: Time-lapse film van eencellige microwound genezing. Verstreken tijd: 20 s. Frame rate: 10 fps. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 2: Time-lapse film van een kleine epitheliale wondgenezing. Verstreken tijd: 9 min 54 s. Frame rate: 10 fps. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 3: Time-lapse film van een kleine epitheliale wondgenezing. Deze wond is groter en onregelmatiger gevormd dan de wond in Film 2. Verstreken tijd: 20 min 54 s. Frame rate: 10 fps. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 4: Time-lapse film van een kleine wond en een microwound genezing met een kelder membraan scheur. Lamellipodia verspreidden zich rond de keldermembraanscheur, hoewel ze over de rest van de ECU kunnen gaan. Zodra het gebied van de wond met de schade aan het keldermembraan is omringd, trekt een samentrekking van de portemonnee cellen over het gebied. Verstreken tijd: 19 min 4 s. Frame rate: 10 fps. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 5: Cellen die sterven in een kleine epitheelwond. Celdood is waarschijnlijk te wijten aan uitdroging van het dier. Verstreken tijd: 4 min 24 s. Frame rate: 10 fps. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 6: Een kleine epitheelwond slaagt er niet in om de genezing te voltooien. Verstreken tijd: 42 min 32 s. Frame rate: 10 fps. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 7: Grote epitheliale wondgenezing. Verstreken tijd: 25 min 29 s. Frame rate: 10 fps. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om deze film te downloaden.
Aanvullende figuur 1: Clytia-tankdimensieschema's. 3D visualisatie van de op maat gemaakte Clytia tanks. (A) Voor- en achteraanzicht. (B) Zijaanzicht. De uitsparing in het groen afgebeelde stuk is bedekt met nylon gaas. Water komt de tank direct over het gaas binnen, veegt over het gaas en creëert een cirkelvormige stroom. Water verlaat het systeem via het gat in het eindstuk dat in blauw is weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende film 1: Acellulaire extracellulaire matrix in Clytia. Z-stack van Clytia genomen met behulp van confocale microscopie. De stack richt zich in eerste instantie op de exumbrella en scant vervolgens elke 10 μm door de ECM naar de plaat endoderm en subparaplu. Afbeeldingen met DIC (links) en Hoechst nucleaire kleuring (rechts) tonen het gebrek aan cellen in de ECM. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Hier wordt de methodologie gepresenteerd voor het in vivo afbeelden van wonden in Clytia, een relatief nieuw ongewerveld modelorganisme40,43,58. Er zijn verschillende factoren die dit systeem tot een uniek en krachtig onderzoeksinstrument maken, anders dan andere modellen die worden gebruikt om wondgenezing en re-epithelisatie te bestuderen. Ten eerste wordt het monolaagsepitheel bevestigd aan een transparante ECM, waardoor het lijkt op in vitro weefselkweektests (figuur 1, figuur 2, figuur 3, figuur 4). Net als in vitro assays kunnen cellen met hoge resolutie in beeld worden gebracht. In tegenstelling tot bij weefselkweek is er echter een authentieke cellulaire omgeving en ECM, zodat wondgenezing kan worden gezien in de context van de complexe signaleringsgebeurtenissen die optreden bij een levend gewond dier. Ten tweede mist Clytia ontstekingsreacties, migrerende fibroblasten, vasculatuur en bloed. Hierdoor kan het re-epithelisatieproces in vivo worden bestudeerd in afwezigheid van de overlappende gebeurtenissen die optreden bij complexere volwassen dieren tijdens wondgenezing59. Ten derde is de ECU acellulair (aanvullende film 1) en groot, waardoor deze gemakkelijk toegankelijk is met een micro-injectienaald (figuur 5 en figuur 6). Met behulp van deze aanpak kunnen onderzoekers het effect testen van farmacologische reagentia die de ECM-structuur verstoren of signaleren op wondgenezing in vivo. Reagentia kunnen ook in epitheelcellen worden ingebracht en hun effecten op in vivo wondgenezing kunnen worden beoordeeld. Ten vierde zijn er protocollen die bestaan voor het creëren van mutanten en transgene dieren in het Clytia-systeem42,43,44,45. In vivo wondgenezing kan daarom worden waargenomen bij dieren met een verhoogde/verminderde expressie van genen van belang.
Er zijn verschillende kritieke stappen in deze techniek. Ten eerste, zoals weergegeven in figuur 3, is het noodzakelijk om een microscoop te gebruiken die correct is geconfigureerd voor DIC-microscopie, omdat de platte, transparante epitheelcellen bijna onzichtbaar zijn met standaard lichtmicroscopie. Het is ook belangrijk om de vaardigheid te ontwikkelen om dieren voorzichtig te verwonden, zodat het epitheel wordt beschadigd zonder de ECU te gutsen. Een vergelijkbare zachte aanraking is nodig voor het micro-injecteren van materialen in de ECU, omdat uitgebreide schade aan het dier tijdens de injectie een volgende analyse van wondgenezing in gevaar kan brengen. Hoewel er een leercurve is voor deze technieken, hebben zelfs beginnende studenten ze snel onder de knie in het Malamy-lab. Inderdaad, deze protocollen zijn gebruikt om celmigratie aan te tonen in niet-gegradueerde laboratoriumcursussen aan de Universiteit van Chicago.
Voor een optimale beeldvorming is het belangrijk dat het dier niet beweegt en het gekozen wondgebied niet uit het gezichtsveld verdwijnt. Als dieren pulseren, is de behandeling met Tricaïne zoals beschreven zeer effectief. Voor driften is het vaak nodig om het monster handmatig te verplaatsen. Deze bewegingen kunnen uit de uiteindelijke film worden verwijderd met behulp van de registratiefunctie in FIJI / ImageJ.
Een beperking met dit systeem is dat het niet mogelijk is om identieke wonden te maken, omdat wonden variëren in zowel vorm als grootte met behulp van de hier beschreven methoden. Daarom kan het moeilijk zijn om de exacte snelheid van wondsluiting of celmigratie te kwantificeren. Positionele markers zoals koolstofkorrels kleven aan de blootgestelde ECM in een gewond dier en kunnen worden gebruikt om de snelheid van collectieve celmigratie in grote wonden te meten (niet weergegeven). Voor analyse van kleine wondsluitingen, zelfs met variabele wondgrootte en -vorm, is er een beperkt bereik van sluitingspercentages bij wonden van deze grootte (figuur 4). Het is daarom mogelijk om de effecten van promotive of repressieve farmacologische reagentia kwantitatief te detecteren.
Hoewel dit werk de karakterisering van wondgenezing beschrijft met behulp van alleen DIC-microscopie, kunnen dezelfde benaderingen worden gebruikt om genezing in beeld te brengen met behulp van fluorescentie of confocale microscopie. Om hierbij te helpen, zijn er protocollen om transgene dieren te genereren waarin verschillende cellulaire en extracellulaire eiwitten fluorescerend worden gelabeld. Gelijktijdige beeldvorming met DIC en fluorescentie, gecombineerd met verstoring van wondgenezing met behulp van farmacologische middelen of mutante lijnen, zal een krachtige benadering zijn om mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan het wondgenezingsproces in het epitheel.
Niets te onthullen.
E.E.L.L. wordt ondersteund door een subsidie van de National Science Foundation PRFB 2011010. We willen Tsuyoshi Momose en Evelyn Houliston bedanken voor hun hulp bij het opzetten van onze Clytia-kolonies, Jean-Baptiste Reynier voor het verzamelen van de microwound-genezingsbeelden, Harry Kyriazes voor de bouw van de pseudo-kreiseltanks en Elizabeth Baldo voor het onderhoud van de Clytia-habitat. Figuur 1B is gemaakt met BioRender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
20500 ACE EKE Microscope Fiber Optic Light Source | Kramer Scientific Corporation | ||
AxioCam 506 mono | ZEISS | 426557-0000-000-MA285 | |
Capillary tubes | World Precision Instruments | TW1004 | |
Cytochalasin B | Abcam | ab143482 | |
Depression slides | Amscope | BS-C12 | |
DMR with DIC options and fluorescence halogen lamp | Leica | ||
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521-10G | |
Fast Green FCF | Thermo Scientific | A16520-06 | |
FM1-43 | Biotium | 70022 | Excitation/Emission: 480/598 nm |
Hoechst 33342 | Thermo Scientific | 62249 | Excitation/Emission: 361/497 nm |
imageJ | NIH | ||
Microloader tips (0.5-10 μL /2-20 μL) | Eppendorf | 930001007 | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | 3301R / M3301L | |
Microscope Cover Glass (22X40-1.5) | Fisherbrand | 12-544-BP | |
Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB085713A | |
PicoNozzle v2 | World Precision Instruments | 5430-ALL | |
Pipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | PV820 | |
Polycarbonate vacuum, desiccator | Bel-art | F42025-0000 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
STEMI Sv11 Dissection scope | ZEISS | STEMI SV11 | |
SYLGARD 184 | Dow Silicones | 1024001 | |
Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
Z-Hab mini system | Pentair | ||
ZEN Microscopy software | Zeiss |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved