Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
यह पेपर एक जीवित क्लिटिया हेमिसफेरिका मेडुसा के उपकला में घाव बनाने और विवो में उच्च रिज़ॉल्यूशन पर छवि घाव भरने की एक विधि का वर्णन करता है। इसके अतिरिक्त, घाव भरने के दौरान उपकला कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स में सिग्नलिंग प्रक्रियाओं को परेशान करने के लिए रंजक और दवाओं को पेश करने की एक तकनीक प्रस्तुत की गई है।
त्वचा से आंखों और आंतों तक सभी जानवरों के अंग, उपकला कोशिकाओं की चादरों से ढके होते हैं जो उन्हें संक्रमण से बचाते हुए होमियोस्टैसिस को बनाए रखने की अनुमति देते हैं। इसलिए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि उपकला घावों की मरम्मत करने की क्षमता सभी मेटाज़ोन्स के लिए महत्वपूर्ण है। कशेरुक में उपकला घाव भरने में अतिव्यापी प्रक्रियाएं शामिल हैं, जिसमें भड़काऊ प्रतिक्रियाएं, वैस्कुलराइजेशन और पुन: उपकलाकरण शामिल हैं। इन प्रक्रियाओं के विनियमन में उपकला कोशिकाओं, पड़ोसी कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के बीच जटिल बातचीत शामिल है; ईसीएम में संरचनात्मक प्रोटीन, नियामक प्रोटीन और सक्रिय छोटे अणु होते हैं। यह जटिलता, इस तथ्य के साथ कि अधिकांश जानवरों में अपारदर्शी ऊतक और दुर्गम ईसीएम होते हैं, जीवित जानवरों में घाव भरने का अध्ययन करना मुश्किल हो जाता है। उपकला घाव भरने पर बहुत काम इसलिए ऊतक संस्कृति प्रणालियों में किया जाता है, जिसमें एक कृत्रिम मैट्रिक्स पर एक मोनोलेयर के रूप में एक एकल उपकला कोशिका-प्रकार चढ़ाया जाता है। क्लिटिया हेमिसफेरिका (क्लिटिया) इन अध्ययनों के लिए एक अद्वितीय और रोमांचक पूरक प्रदान करता है, जिससे उपकला घाव भरने को एक प्रामाणिक ईसीएम के साथ एक बरकरार जानवर में अध्ययन करने की अनुमति मिलती है। क्लिटिया का एक्टोडर्मल एपिथेलियम बड़े स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं की एक एकल परत है, जो जीवित जानवरों में अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की अनुमति देता है। प्रवासी फाइब्रोब्लास्ट्स, वास्कुलचर या भड़काऊ प्रतिक्रियाओं की अनुपस्थिति विवो में पुन: उपकलाकरण में महत्वपूर्ण घटनाओं को विच्छेदित करना संभव बनाती है। विभिन्न प्रकार के घावों के उपचार का विश्लेषण किया जा सकता है, जिसमें एकल-कोशिका माइक्रोघाव, छोटे और बड़े उपकला घाव और घाव शामिल हैं जो तहखाने की झिल्ली को नुकसान पहुंचाते हैं। लैमेलिपोडिया गठन, पर्स स्ट्रिंग संकुचन, सेल स्ट्रेचिंग और सामूहिक सेल माइग्रेशन सभी इस प्रणाली में देखे जा सकते हैं। इसके अलावा, विवो में सेल: ईसीएम इंटरैक्शन और सेलुलर प्रक्रियाओं को संशोधित करने के लिए ईसीएम के माध्यम से औषधीय एजेंटों को पेश किया जा सकता है। यह काम लाइव क्लिटिया में घाव बनाने, उपचार की फिल्मों को कैप्चर करने और ईसीएम में अभिकर्मकों को माइक्रोइंजेक्ट करके उपचार तंत्र की जांच करने के तरीकों को दिखाता है।
उपकला कोशिकाओं की चादरें सभी मेटाज़ोन्स की बाहरी सतह को कवर करती हैं, आंतरिक अंगों को पंक्तिबद्ध करती हैं, और पशु शरीर को असतत डिब्बों में विभाजित करती हैं। एपिथेलियम आंतरिक शरीर को बाहरी वातावरण से भी अलग करता है और इसे नुकसान और संक्रमण से बचाता है। इसलिए, उपकला परतों का आगमन बहुकोशिकीय जानवरों के विकास का एक अनिवार्य हिस्सा था, और उपकला परतें कशेरुक से लेकर सबसे बेसल मेटाज़ोन्स1 तक सभी जानवरों में देखी जाती हैं। कुछ अंगों का एपिथेलियम एक एकल मोनोलेयर है, जैसे कि फेफड़ों की वायु थैली, रक्त वाहिकाओं और आंत2 में, साथ ही साथ अकशेरुकी जीवों के एपिडर्मिस में जैसे कि प्लेनेरिया और सीनिडेरियन3। अन्य ऊतकों में, जैसे कि कशेरुक की त्वचा4 और कॉर्निया5, उपकला को स्तरीकृत किया जाता है, जिसका अर्थ है कि कई उपकला कोशिका परतें2 हैं। सभी मामलों में, सबसे बेसल उपकला परत तहखाने की झिल्ली से चिपकी होती है, एक प्रोटीन शीट जो बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) 6,7,8 का एक विशेष क्षेत्र बनाती है।
एक निरंतर उपकला शीट को फिर से बनाने के लिए एपिथेलियम में दरारों की तेजी से मरम्मत की जानी चाहिए। उपकला को नुकसान प्राकृतिक प्रक्रियाओं के दौरान होता है, जैसे कि आंत में उपकला कोशिकाओं का बहाव, 9,10 और सूजन या शारीरिक आघात के परिणामस्वरूप। जब एक एकल उपकला कोशिका क्षतिग्रस्त हो जाती है, तो इसे या तो खुद की मरम्मत करनी चाहिए या आसपास की कोशिकाओं को एक दूसरे से जुड़ने और छेद11,12 को बंद करने की अनुमति देने के लिए समाप्त कर दिया जाना चाहिए। एकल कोशिका के आकार से बड़े घावों में, उपकला कोशिकाओं को एक दूसरे तक पहुंचने और शीट13 की मरम्मत करने के लिए आगे बढ़ना चाहिए। यह कोशिका प्रसार द्वारा प्राप्त किया जा सकता है यदि अंतराल छोटे हैं या घाव के अंतर को बंद करने के लिए घाव के किनारे से उपकला कोशिकाओं के प्रवास की आवश्यकता हो सकती है; इस बाद की प्रक्रिया को पुन: उपकलाकरण14,15 कहा जाता है। भ्रूण के ऊतकों में, उपकला कोशिकाएं फैलती हैं और घावों को बंद करने के लिए पलायन करती हैं या घाव मार्जिन पर कोशिकाओं के बीच बनने वाले एक्टोमायोसिन केबलों के संकुचन से अंतर में खींची जाती हैं, पर्स स्ट्रिंग16 के समान एक तंत्र में। कई वयस्क ऊतकों में, पुन: उपकलाकरण में सुसंगत सेल शीट का प्रवास शामिल है, जहां कोशिकाएं पड़ोसी कोशिकाओं 14,17,18 के साथ अपने जंक्शनों को बनाए रखती हैं। अन्य ऊतकों में, कोशिका: कोशिका कनेक्शन विघटित हो जाते हैं और उपकला कोशिकाएं मेसेनकाइमल कोशिकाओं की तरह अधिक व्यवहार करती हैं, जो पुन: उपकलाकरण 14,19,20,21 के दौरान घाव क्षेत्र में समन्वित लेकिन स्वतंत्र तरीके से चलती हैं।
एपिथेलियल सेल आंदोलनों को माइग्रेटिंग कोशिकाओं के बीच और कोशिकाओं और ईसीएम के बीच जटिल बातचीत द्वारा नियंत्रित किया जाता है। जबकि उपकला कोशिकाओं के घाव-सक्रियण और बाद के प्रवास के तंत्र को संबोधित करने वाले प्रयोगात्मक साहित्य की एक जबरदस्त मात्रा है, अभी भी बहुत कुछ खोजा जाना बाकी है। उदाहरण के लिए, प्रारंभिक संकेत जो एक घाव के जवाब में उपकला कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए सक्रिय करता है, निश्चित रूप से पहचाना नहीं गया है 22, न ही यह पूरी तरह से समझा जाता है कि घाव 22,23,24,25,26,27 के निकटतम उपकला कोशिकाओं के पक्ष में लैमेलिपोडिया बनाने के लिए एक्टिन को कैसे पुन: तैनात किया जाता है।. सामूहिक कोशिका प्रवास के लिए घाव पर कोशिकाओं से जानकारी की आवश्यकता होती है जिसे घाव से बाहर की कोशिकाओं के साथ साझा किया जाता है, और संचार मार्ग अभीभी स्पष्ट नहीं है। सेल: सेल जंक्शन और सेल: ईसीएम अटैचमेंट को अलग किया जाना चाहिए और सुधार किया जाना चाहिए क्योंकि शीट में कोशिकाएं खुद को पुनर्व्यवस्थित करती हैं, लेकिन इस प्रक्रिया का विनियमन खराब समझा जाता है14,29। इन और अन्य संबंधित प्रश्नों पर प्रगति करना न केवल एक मौलिक जैविक समस्या के रूप में महत्वपूर्ण है, बल्कि सही घाव भरने के नैदानिक महत्व के कारण भी महत्वपूर्ण है। रोग जो उपकला कोशिकाओं की सही ढंग से पलायन करने की क्षमता से समझौता करते हैं, वे पुराने घावों में परिणाम देते हैं; एक उदाहरण आनुवंशिक बीमारी एपिडर्मोलिसिस बुलोसा है, जहां ईसीएम के लिए उपकला कोशिकाओं के लगाव में शामिल जीन उत्परिवर्तित होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप नाजुक त्वचा होती है जो छीलती है और फफोले होती है। प्राकृतिक रूप से उम्र बढ़ने वाले ऊतकों30,31 में पुन: उपकलाकरण भी समझौता किया जाता है। इसलिए घाव भरने के परिणामों में सुधार के लिए हस्तक्षेप विकसित करने के लिए एक बेहतर समझ आवश्यक है।
घाव भरने में उपकला कोशिका प्रवास का अध्ययन इन विट्रो दृष्टिकोण और मॉडल जीवों दोनों का उपयोग करके किया गया है। घाव भरने और सेल माइग्रेशन के तंत्र के अधिकांश अध्ययन ऊतक संस्कृति में किए गए हैं, जहां एक एकल उपकला कोशिका प्रकार के मोनोलेयर एक सब्सट्रेट पर उगाए जाते हैं जो ईसीएम के लिए विकल्प होता है। सेल मोनोलेयर को विशिष्ट आकृतियों और आकारों के अंतराल बनाने के लिए या तो खरोंच या स्टैंसिल के साथ उगाया जाता है और फिर32,33,34 देखा जाता है। इन विट्रो मॉडल सेल व्यवहार के एक आदर्श विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है, साथ ही सब्सट्रेट के गुणों को बदलने का अवसर, कोशिकाओं को दवाओं और अजैविक और जैविक कारकों को उजागर करने के लिए, और संरचनाओं के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए जो रुचि के विभिन्न जीनों को व्यक्त या दबाते हैं। हालांकि, यह न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोण विवो संदर्भ में उपकला कोशिका व्यवहार में शामिल कुछ महत्वपूर्ण मापदंडों को पकड़ने में विफल हो सकता है, जिसमें ईसीएम11 में होने वाले विभिन्न सेल प्रकारों और सिग्नलिंग घटनाओं के बीच संचार शामिल है। विवो मॉडल में एक घाव का प्रामाणिक संदर्भ प्रदान करता है, जिसमें कई सेल प्रकार, अतिव्यापी सिग्नलिंग मार्ग और एक जटिल ईसीएम35 होता है। घाव भरने के अध्ययन के लिए ऐसा एक मॉडल माउस19 है, जिसमें हाल की प्रगति ने शोधकर्ताओं कोजीवित जानवरों में पूर्ण मोटाई के घावों के उपचार के दौरान एपिडर्मल कोशिकाओं का निरीक्षण करने की अनुमति दी है। हालांकि, विवो सिस्टम में माउस और अन्य पुन: उपकलाकरण का अध्ययन करने के लिए चुनौतियां पेश करते हैं। सबसे पहले, एक प्राकृतिक संदर्भ में सेल व्यवहार को देखने का बड़ा लाभ कशेरुक घाव भरने के दौरान होने वाली अस्थायी रूप से अतिव्यापी घटनाओं की जटिलता से संतुलित होता है, जिसमें रक्त के थक्के, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती और सूजन, फाइब्रोब्लास्ट की भर्ती, और सेल डी-भेदभाव, पुन: वैस्कुलराइजेशन और ईसीएम के रीमॉडेलिंग शामिल हैं। इसके अलावा, अपारदर्शी ऊतक इमेजिंग को मुश्किल बनाते हैं। ड्रोसोफिला लार्वा और ज़ेब्राफिश एपिडर्मिस सिस्टम37,38 ने अपनी सापेक्ष सादगी के कारण इनमें से कुछ कठिनाइयों को दूर कियाहै।
हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में उपकला घाव भरने का अध्ययन करने के लिए एक नया मॉडल पेश किया: हाइड्रोज़ोन सीनिडेरियन क्लिटिया हेमिसफेरिका (क्लिटिया) 40 का मेडुसा (जेलीफिश) रूप। क्लिटिया एक उभरता हुआ मॉडल जीव है जिसमें पूरी तरह से अनुक्रमित और एनोटेटेड जीनोम 41, एकल कोशिका आरएनएसेक ट्रांसस्क्रिप्टम42, और जीनोम संशोधन (म्यूटेनेसिस और ट्रांसजेनेसिस) 43,44,45 के लिए प्रोटोकॉल हैं। निडारियन उपकला परतों वाले सबसे पुराने विलुप्त वंशों में से एक हैं, इसलिए निडारियन घाव भरने को समझना पैतृक मार्गों में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो उपकला अखंडता सुनिश्चित करते हैं। उन मार्गों के लिए जिन्हें जीवन के पूरे पेड़ में संरक्षित किया गया है, क्लिटिया उपकला कोशिका गतिशीलता और विवो में घाव भरने के कार्यात्मक विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक रोमांचक नई प्रणाली प्रदान करता है।
क्लिटिया मेडुसा (एक्सअम्ब्रेला) की ऊपरी सतह को कवर करने वाला एपिथेलियम पारदर्शी, स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं का एक मोनोलेयर है जो लगभग 50 μm चौड़ा 1-2 μm मोटा है (चित्र 1)। वे मेसोग्लिया नामक एक ईसीएम से जुड़े होते हैं - जेलीफिश की "जेली"। मेसोग्लिया अन्य जानवरों 46,47,48 में पाए जाने वाले ईसीएम के समान है, जिसमें कशेरुक भी शामिल है, इसमें एक तहखाने की झिल्ली 40 है, और यह पूरी तरह से पारदर्शी है। क्लिटिया मेडुसा में उपकला परत को आसानी से खरोंच या घायल किया जा सकता है (नीचे देखें)। एपिथेलियम और ईसीएम की सादगी और पारदर्शिता उपचार के दौरान कोशिकाओं और उनके आंदोलनों की उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की अनुमति देती है। हाल ही में, कामरान एट अल ने क्लिटिया एपिथेलियम में छोटे घावों के उपचार को विस्तार से40 में चित्रित किया। यह प्रदर्शित किया गया था कि क्लिटिया में उपचार लैमेलिपोडिया-आधारित सेल-क्रॉलिंग, सेल प्रसार और सामूहिक सेल माइग्रेशन के साथ-साथ पर्स स्ट्रिंग क्लोजर के माध्यम से होता है जो भ्रूण प्रणालियों के लिए अधिक विशिष्ट है (हालांकि पहले कॉर्निया49 जैसे वयस्क पशु संरचनाओं में देखा गया था)। क्लिटिया घाव भरना बेहद तेज है, जैसा कि अन्य प्रणालियों में देखा गया है जिनमें भड़काऊ प्रतिक्रिया40,50 की कमी है। क्लिटिया एक्सअम्ब्रेला में उपचार पूरी तरह से मौजूदा उपकला कोशिकाओं के आंदोलनों पर निर्भर है - कोई भी कोशिका ईसीएम के माध्यम से घाव स्थल तक प्रसार या पलायन नहीं करती है (पूरक मूवी 1)। इन सभी निष्कर्षों से पता चलता है कि क्लिटिया उपकला घाव भरने का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली है। दरअसल, घाव भरने के दौरान क्लिटिया में उपकला कोशिकाओं की इमेजिंग की आसानी ने यह खोज की कि उपकला कोशिका लैमेलिपोडिया उजागर ईसीएम के क्षेत्रों में फैली हुई है और फैली हुई है जब तक कि एक बरकरार तहखाने की झिल्ली है; यदि तहखाने की झिल्ली क्षतिग्रस्त हो जाती है, तो उपकला उपचार पर्स स्ट्रिंग तंत्र40 में बदल जाता है। यह लैमेलिपोडिया-आधारित क्रॉलिंग बनाम पर्स स्ट्रिंग क्लोजर द्वारा बंद करने के निर्णय को अंतर्निहित तंत्र का पहला प्रदर्शन था, जो उपचार में विशिष्ट सेल: ईसीएम इंटरैक्शन के महत्व पर प्रकाश डालता है और उनके प्राकृतिक संदर्भ में कोशिकाओं का अवलोकन करता है।
नीचे, एकल-कोशिका माइक्रोघाव, छोटे घाव जो मुख्य रूप से सेल फैलने से बंद हो जाते हैं, और बड़े घाव जिन्हें बंद करने के लिए सामूहिक सेल माइग्रेशन की आवश्यकता होती है, बनाने और इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। इसके अलावा, ईसीएम और उपकला कोशिकाओं में छोटे अणुओं की शुरूआत के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जिससे घाव भरने के कथित नियामक मार्गों के प्रयोगात्मक गड़बड़ी की अनुमति मिलती है।
1. पशु संस्कृति
2. चोट लगना
चित्रा 1: क्लिटिया मेडुसा में बरकरार और घायल एक्सब्रेला एपिथेलियल परत। (ए) क्लिटिया मेडुसा शरीर का कार्टून ग्राफिक। (A') बरकरार मेडुसा एक्सअम्ब्रेला एपिथेलियम ऊपर से देखा गया। (बी) नीले रंग में उपकला कोशिकाओं के साथ एकल-कोशिका माइक्रोवाउंड (लाल टैग किए गए आकार) का कार्टून। (B') एकल कोशिका माइक्रोघाव। (सी) एक छोटे उपकला घाव का कार्टून (लाल जालीदार आकार)। (C') छोटे उपकला घाव। (डी) एक बड़े उपकला घाव का कार्टून (लाल जालीदार आकार)। (D') बड़ा उपकला घाव। सभी छवियां डीआईसी माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्राप्त की गई थीं। (A'-C') में स्केल सलाखों: 50 μm. स्केल बार (D'): 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: कई आकार के घाव और एक क्षतिग्रस्त तहखाने झिल्ली। एक विशिष्ट छोटा एक्सअम्ब्रेला एपिथेलियल घाव दिखाया गया है, जिसमें लेबल लैमेलिपोडिया का संकेत देते हैं जो सीमांत कोशिकाओं से बनते हैं। इसके अलावा, उपकला कोशिकाओं के भीतर और बीच में माइक्रोघाव देखे जाते हैं। घाव के ऊपरी हिस्से में छोटे तहखाने की झिल्ली के आंसू पर ध्यान दें। फिल्म 4 इस घाव के उपचार को दिखाती है। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
3. इमेजिंग उपकला घाव भरने
चित्रा 3: एक्सब्रेब्रेलर एपिथेलियम में एक छोटा घाव बनाना। (ए) एक छोटा उपकला घाव बनाने के लिए 200 μL पिपेट टिप के साथ एक्सब्रेब्रेला का कोमल खरोंच। (बी) कवरस्लिप रखना कभी-कभी छोटे उपकला घावों को बनाने के लिए पर्याप्त होता है। (सी) मेडुसा एक अवसाद स्लाइड पर लगाया गया। (डी) डीआईसी प्रकाशिकी के बिना छोटे उपकला घाव की छवि और डीआईसी प्रकाशिकी के साथ (ई)। स्केल सलाखों: 50 μm कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
4. विश्लेषण
चित्रा 4: छोटे उपकला घावों में घाव क्षेत्र का विश्लेषण। (ए) 10 मिनट से अधिक एक छोटे उपकला घाव भरने का उदाहरण। (बी) 21 मिनट से अधिक एक अलग उपकला घाव भरने का उदाहरण। ए, बी में बैंगनी रूपरेखा फिजी / इमेजजे में लासो टूल का उपयोग करके घाव क्षेत्रों के माप के बराबर है। (सी) ए में समय के साथ घाव क्षेत्र की सामान्यीकृत कमी। (डी) बी में समय के साथ घाव क्षेत्र की सामान्यीकृत कमी। (ई) 14 छोटे घावों के लिए समय के साथ घाव क्षेत्र की औसत कमी। n = 14. त्रुटि पट्टियाँ माध्य ± SEM के आसपास केंद्रित हैं. स्केल सलाखों: 50 μm कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
5. मेसोगल इंजेक्शन
चित्रा 5: ईसीएम में रंजक या दवाओं को पेश करने के लिए इंजेक्शन सेटअप। (ए) इंजेक्शन सेटअप। (बी) माइक्रोइंजेक्शन सुई अभिविन्यास (डिश में जानवर के सापेक्ष लगभग 45 डिग्री कोण) दिखाने वाले इंजेक्शन सेटअप का क्लोज-अप। (सी) इंजेक्शन के लिए एएसडब्ल्यू की थोड़ी मात्रा में मेडुसा के साथ सिलिकॉन इंजेक्शन डिश का क्लोज-अप। (डी) फास्ट ग्रीन एफसीएफ से भरी एक माइक्रोइंजेक्शन सुई सबअम्ब्रेला के माध्यम से मेडुसा के मेसोग्लिया में प्रवेश करती है। (ङ) माउंटेड मेडुसा में फास्ट ग्रीन एफसीएफ का इंजेक्शन लगाया जाना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
उपरोक्त प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, एकल-कोशिका माइक्रोघाव, छोटे घाव और बड़े घावों की छवि बनाई गई थी। छवि फ़ाइलों के पंजीकृत ढेर .avi फ़ाइलों के रूप में सहेजे गए थे।
मूवी 1 में, माइक्रोवाउंड को कोशिकाओं के बीच और भीतर बंद होते देखा जा सकता है (चित्रा 1 और चित्रा 2)। बंद होने के दौरान छोटे लैमेलिपोडिया देखे जाते हैं, इसके बाद संकुचन और उपचार होता है। मलबे को बाहर रखा जाता है और पानी में छोड़ दिया जाता है। उपचार एक मिनट या उससे कम समय में पूरा हो जाता है।
मूवी 2 और 3 में, विभिन्न आकृतियों के छोटे घाव लैमेलिपोडिया के गठन, लैमेलिपोडियाल संपर्कों के विस्तार और घाव मार्जिन पर कोशिकाओं के प्रसार के माध्यम से ठीक हो जाते हैं, जैसा कि पहले वर्णित40 (चित्रा 1 और चित्रा 2)। सीमांत कोशिकाओं के पीछे स्तरों में कोशिकाएं इस आकार के घावों के उपचार में भाग नहीं लेती हैं और न ही सामूहिक सेल माइग्रेशन होता है। उपकला अंतराल के तेजी से और प्रगतिशील बंद होने के बाद नवगठित घाव सीम40 के साथ ऊतक संकुचन होता है। समय के साथ मूल क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में व्यक्त इन दो घावों के उपचार की सामान्यीकृत दर दिखाई गई है (चित्रा 4 सी, डी)। जबकि घाव बंद होने की गतिशीलता में कुछ परिवर्तनशीलता है, 0.02-0.125 मिमी2 से लेकर विभिन्न आकारों के 14 घावों के लिए समय के साथ प्रतिशत क्षेत्र बंद होने का औसत अनुपचारित जानवरों में घाव भरने के लिए एक औसत वक्र की स्थापना की अनुमति देता है (चित्रा 4 ई)।
तहखाने की झिल्ली को नुकसान स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है जब यह होता है (चित्रा 2)। मूवी 4 में, एक छोटे से घाव के मार्जिन पर कोशिकाएं जिसमें क्षतिग्रस्त क्षेत्र के चारों ओर तहखाने की झिल्ली की क्षति फैली हुई है, और गैप क्लोजर एक पर्स स्ट्रिंग संकुचन के साथ पूरा होता है।
यदि ऊतक निर्जलित है या मरम्मत के लिए बहुत क्षतिग्रस्त है, तो सेल आंदोलन बंद हो सकते हैं, या कोशिकाओं की पूरी शीट फट सकती है (मूवी 5 और मूवी 6)। यह आमतौर पर इमेजिंग की लंबी अवधि (45 मिनट या उससे अधिक) के बाद होता है। यदि इमेजिंग में सेल फटना जल्दी होता है, तो नमूना छोड़ दिया जाता है।
जैसा कि मूवी 7 में दिखाया गया है, बड़े घाव कई चरणों में ठीक हो जाते हैं। सबसे पहले, मार्जिन पर संकुचन के कारण घाव का किनारा चिकना और नियमित हो जाता है, जैसा किपहले बताया गया था। फिर, लैमेलिपोडिया को घाव के मार्जिन पर कोशिकाओं से बनते देखा जाता है, जिसमें लैमेलिपोडिया आसन्न लैमेलिपोडिया के साथ संपर्क को अधिकतम करने के लिए आगे बढ़ता है। घाव मार्जिन पर कोशिकाओं में नाभिक की ट्रैकिंग और सीमांत कोशिकाओं के पीछे कई स्तरों से पता चलता है कि सामूहिक सेल माइग्रेशन40 द्वारा बड़े अंतराल बंद हो जाते हैं। कोशिकाएं कभी अलग नहीं होती हैं, लेकिन एक शीट के रूप में एक साथ चलती हैं।
रंगों और औषधीय एजेंटों की शुरूआत जैविक तंत्र के विच्छेदन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकती है। कई पदार्थों को क्लिटिया (नहीं दिखाया गया) से बाहर रखा गया है, संभवतः बलगम परत के कारण जो जानवर की सतह को कोट करता है। हालांकि, माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग ईसीएम में अणुओं को सीधे पेश करने, ईसीएम संरचना को बाधित करने या ईसीएम में नियामक गतिविधियों को परेशान करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, रंजक और अन्य अणु बेसल साइड से उपकला कोशिकाओं में प्रवेश करने में सक्षम हैं। उदाहरण के लिए, चित्र 6 में होचस्ट के साथ परमाणु धुंधलापन, एफएम 1-43 के साथ झिल्ली धुंधला होना, और इन अभिकर्मकों को ईसीएम में माइक्रोइंजेक्ट किए जाने के बाद साइटोक्लासिन बी द्वारा लैमेलिपोडिया गठन का निषेध दिखाया गया है। घायल होने से पहले ईसीएम और उपकला कोशिकाओं में इन अणुओं का परिचय उन प्रयोगों की अनुमति देता है जो उपचार प्रक्रिया पर औषधीय उपकरणों के प्रभाव का परीक्षण करते हैं।
चित्रा 6: रंजक या औषधीय एजेंटों के माइक्रोइंजेक्शन के बाद मेडुसा की उपकला कोशिकाएं। (ए ) उपकला कोशिकाओं को 20 μM Hoechst (नाभिक) और 50 μM FM1-43 (झिल्ली) के साथ इंजेक्शन के 5 मिनट बाद शीर्ष पैनल में दिखाया गया। (बी, सी) 1: 1,000 डीएमएसओ नियंत्रण ( बी ) या 100 μM Cytochalasin B (C) के साथ इंजेक्शन के बाद घाव भरने। इंजेक्शन के 15 मिनट बाद घाव किए गए थे। चित्र घायल होने के 5 मिनट बाद लिए गए थे। लैमेलिपोडिया का गठन साइटोक्लासिन बी द्वारा बाधित होता है। घाव क्षेत्र में कोशिकाओं के बीच अक्सर देखे जाने वाले स्पष्ट "फाइबर" को तहखाने की झिल्ली को फैलाने वाले तनाव का परिणाम माना जाता है - वे फैलोइडिन के साथ दाग नहीं करते हैं (दिखाया नहीं गया है)। स्केल सलाखों: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
मूवी 1: सिंगल सेल माइक्रोवाउंड हीलिंग की टाइम-लैप्स फिल्म। समय बीत गया: 20 सेकंड। फ्रेम दर: 10 एफपीएस। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
मूवी 2: एक छोटे उपकला घाव भरने की टाइम-लैप्स फिल्म। समय बीत गया: 9 मिनट 54 सेकंड। फ्रेम दर: 10 एफपीएस। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
मूवी 3: एक छोटे से उपकला घाव भरने की टाइम-लैप्स फिल्म। यह घाव मूवी 2 में घाव की तुलना में बड़ा और अधिक अनियमित आकार का है। समय बीत गया: 20 मिनट 54 सेकंड। फ्रेम दर: 10 एफपीएस। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
मूवी 4: एक छोटे से घाव की टाइम-लैप्स फिल्म और एक तहखाने की झिल्ली के आंसू के साथ एक माइक्रोवंड उपचार। लैमेलिपोडिया तहखाने की झिल्ली के चारों ओर फैल गया, हालांकि वे ईसीएम के बाकी हिस्सों पर आगे बढ़ सकते हैं। एक बार जब तहखाने की झिल्ली की क्षति के साथ घाव का क्षेत्र घिरा हुआ है, तो एक पर्स स्ट्रिंग संकुचन क्षेत्र पर कोशिकाओं को खींचता है। समय बीत गया: 19 मिनट 4 सेकंड। फ्रेम दर: 10 एफपीएस। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
फिल्म 5: एक छोटे उपकला घाव में कोशिकाएं मर रही हैं। पशु के निर्जलीकरण के कारण कोशिका मृत्यु की संभावना है। समय बीत गया: 4 मिनट 24 सेकंड फ्रेम दर: 10 एफपीएस। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
फिल्म 6: एक छोटा उपकला घाव उपचार को पूरा करने में विफल रहता है। समय बीत गया: 42 मिनट 32 सेकंड। फ्रेम दर: 10 एफपीएस। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
फिल्म 7: बड़े उपकला घाव उपचार। समय बीत गया: 25 मिनट 29 सेकंड। फ्रेम दर: 10 एफपीएस। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्र 1: क्लिटिया टैंक आयाम योजनाबद्ध। कस्टम-निर्मित क्लिटिया टैंक का 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन। (ए) सामने और पीछे का दृश्य। (बी) साइड व्यू। हरे रंग में दिखाए गए टुकड़े में कट-आउट नायलॉन जाल से ढका हुआ है। पानी जाल के ऊपर सीधे टैंक में प्रवेश करता है, जाल पर झाड़ू लगाता है और एक गोलाकार प्रवाह बनाता है। नीले रंग में दिखाए गए अंतिम टुकड़े में छेद के माध्यम से पानी सिस्टम से बाहर निकलता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक मूवी 1: क्लिटिया में एककोशिकीय बाह्य मैट्रिक्स। क्लिटिया का जेड-स्टैक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लिया गया। स्टैक शुरू में एक्सअम्ब्रेला पर केंद्रित होता है और फिर ईसीएम के माध्यम से प्लेट एंडोडर्म और सबअम्ब्रेला में हर 10 μm स्कैन करता है। डीआईसी (बाएं) और होचस्ट परमाणु धुंधला (दाएं) का उपयोग करने वाली छवियां ईसीएम में कोशिकाओं की कमी को प्रदर्शित करती हैं। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
यहां, क्लिटिया में विवो में इमेजिंग घावों के लिए कार्यप्रणाली प्रस्तुत की गई है, जो एक अपेक्षाकृत नया अकशेरुकी मॉडल जीव40,43,58 है। ऐसे कई कारक हैं जो इस प्रणाली को एक अद्वितीय और शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण बनाते हैं, जो घाव भरने और पुन: उपकलाकरण का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य मॉडलों से अलग हैं। सबसे पहले, मोनोलेयर एपिथेलियम एक पारदर्शी ईसीएम से जुड़ा होता है, इसलिए इन विट्रो ऊतक संस्कृति परख (चित्रा 1, चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4) जैसा दिखता है। जैसा कि इन विट्रो परख ों में, कोशिकाओं को उच्च रिज़ॉल्यूशन पर चित्रित किया जा सकता है। हालांकि, ऊतक संस्कृति के विपरीत, एक प्रामाणिक सेलुलर वातावरण और ईसीएम है, ताकि घाव भरने को एक जीवित घायल जानवर में होने वाली जटिल सिग्नलिंग घटनाओं के संदर्भ में देखा जा सके। दूसरा, क्लिटिया में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, प्रवासी फाइब्रोब्लास्ट, वाहिका और रक्त की कमी होती है। यह घाव भरने के दौरान अधिक जटिल वयस्क जानवरों में होने वाली अतिव्यापी घटनाओं की अनुपस्थिति में विवो में पुन: उपकलाकरण प्रक्रिया काअध्ययन करने की अनुमति देता है। तीसरा, ईसीएम एककोशिकीय (पूरक मूवी 1) और बड़ा है, जो माइक्रोइंजेक्शन सुई (चित्रा 5 और चित्रा 6) के साथ आसान पहुंच की अनुमति देता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, शोधकर्ता औषधीय अभिकर्मकों के प्रभाव का परीक्षण कर सकते हैं जो विवो में घाव भरने पर ईसीएम संरचना या सिग्नलिंग को परेशान करते हैं। अभिकर्मकों को उपकला कोशिकाओं में भी पेश किया जा सकता है, और विवो घाव भरने में उनके प्रभाव का आकलन किया जा सकता है। चौथा, ऐसे प्रोटोकॉल हैं जो क्लिटिया प्रणाली 42,43,44,45 में उत्परिवर्ती और ट्रांसजेनिक जानवरों को बनाने के लिए मौजूद हैं। विवो में घाव भरने को इसलिए जानवरों में रुचि के जीन की बढ़ी हुई / कम अभिव्यक्ति के साथ देखा जा सकता है।
इस तकनीक में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना आवश्यक है जो डीआईसी माइक्रोस्कोपी के लिए सही ढंग से कॉन्फ़िगर किया गया है क्योंकि सपाट, पारदर्शी उपकला कोशिकाएं मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ लगभग अदृश्य हैं। जानवरों को धीरे से घाव करने के लिए कौशल विकसित करना भी महत्वपूर्ण है ताकि ईसीएम को प्रभावित किए बिना उपकला क्षतिग्रस्त हो जाए। ईसीएम में माइक्रोइंजेक्टिंग सामग्री के लिए एक समान सौम्य स्पर्श आवश्यक है, क्योंकि इंजेक्शन के दौरान जानवर को व्यापक नुकसान घाव भरने के बाद के विश्लेषण से समझौता कर सकता है। जबकि इन तकनीकों के लिए एक सीखने की अवस्था है, यहां तक कि शुरुआती छात्रों ने उन्हें मलामी प्रयोगशाला में जल्दी से महारत हासिल की है। दरअसल, इन प्रोटोकॉल का उपयोग शिकागो विश्वविद्यालय में स्नातक प्रयोगशाला पाठ्यक्रमों में सेल माइग्रेशन का प्रदर्शन करने के लिए किया गया है।
इष्टतम इमेजिंग के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि जानवर हिलता नहीं है और चुना हुआ घाव क्षेत्र दृश्य के क्षेत्र से बाहर नहीं निकलता है। यदि जानवर स्पंदन कर रहे हैं, तो वर्णित ट्राइकेन के साथ उपचार बहुत प्रभावी है। बहने के लिए, नमूने को मैन्युअल रूप से पुनर्स्थापित करना अक्सर आवश्यक होता है। इन आंदोलनों को फिजी / इमेजजे में पंजीकरण फ़ंक्शन का उपयोग करके अंतिम फिल्म से हटाया जा सकता है।
इस प्रणाली के साथ एक सीमा यह है कि समान घाव बनाना संभव नहीं है, क्योंकि घाव यहां वर्णित तरीकों का उपयोग करके आकार और आकार दोनों में भिन्न होते हैं। इसलिए, घाव बंद होने या सेल माइग्रेशन की सटीक दर की मात्रा निर्धारित करना मुश्किल हो सकता है। कार्बन अनाज जैसे स्थितिगत मार्कर एक घायल जानवर में उजागर ईसीएम से चिपक जाते हैं और बड़े घावों में सामूहिक सेल प्रवास की दर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (दिखाया नहीं गया)। छोटे घाव बंद करने के विश्लेषण के लिए, यहां तक कि परिवर्तनीय घाव के आकार और आकार के साथ, इस आकार के घावों के बीच बंद होने की दरों की एक सीमित सीमा है (चित्रा 4)। इसलिए मात्रात्मक रूप से प्रोत्साहक या दमनकारी औषधीय अभिकर्मकों के प्रभावों का पता लगाना संभव है।
जबकि यह काम केवल डीआईसी माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके घाव भरने के लक्षण वर्णन का वर्णन करता है, उसी दृष्टिकोण का उपयोग प्रतिदीप्ति या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उपचार की छवि बनाने के लिए किया जा सकता है। इसमें सहायता के लिए, ट्रांसजेनिक जानवरों को उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल हैं जिसमें विभिन्न सेलुलर और बाह्य प्रोटीन फ्लोरोसेंटली लेबल किए जाते हैं। डीआईसी और प्रतिदीप्ति के साथ समवर्ती इमेजिंग, औषधीय एजेंटों या उत्परिवर्ती लाइनों का उपयोग करके घाव भरने की गड़बड़ी के साथ संयुक्त, उपकला में घाव भरने की प्रक्रिया को कम करने वाले तंत्र को समझने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण होगा।
खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं।
ई.ई.एल.एल. को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन पीआरएफबी 2011010 से अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है। हम अपनी क्लिटिया कॉलोनियों को स्थापित करने में हमारी मदद करने के लिए त्सुयोशी मोमोसे और एवलिन हौलिस्टन को धन्यवाद देना चाहते हैं, जीन-बैपटिस्ट रेनियर को माइक्रोवाउंड उपचार छवियों के संग्रह के लिए, हैरी किरियाज़ेस को छद्म-क्रीसेल टैंक ों के निर्माण के लिए, और एलिजाबेथ बाल्डो को क्लिटिया निवास स्थान को बनाए रखने के लिए। चित्र 1B BioRender.com के साथ बनाया गया था।
Name | Company | Catalog Number | Comments |
20500 ACE EKE Microscope Fiber Optic Light Source | Kramer Scientific Corporation | ||
AxioCam 506 mono | ZEISS | 426557-0000-000-MA285 | |
Capillary tubes | World Precision Instruments | TW1004 | |
Cytochalasin B | Abcam | ab143482 | |
Depression slides | Amscope | BS-C12 | |
DMR with DIC options and fluorescence halogen lamp | Leica | ||
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521-10G | |
Fast Green FCF | Thermo Scientific | A16520-06 | |
FM1-43 | Biotium | 70022 | Excitation/Emission: 480/598 nm |
Hoechst 33342 | Thermo Scientific | 62249 | Excitation/Emission: 361/497 nm |
imageJ | NIH | ||
Microloader tips (0.5-10 μL /2-20 μL) | Eppendorf | 930001007 | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | 3301R / M3301L | |
Microscope Cover Glass (22X40-1.5) | Fisherbrand | 12-544-BP | |
Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB085713A | |
PicoNozzle v2 | World Precision Instruments | 5430-ALL | |
Pipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | PV820 | |
Polycarbonate vacuum, desiccator | Bel-art | F42025-0000 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
STEMI Sv11 Dissection scope | ZEISS | STEMI SV11 | |
SYLGARD 184 | Dow Silicones | 1024001 | |
Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
Z-Hab mini system | Pentair | ||
ZEN Microscopy software | Zeiss |
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