이 연구는 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램 No. 2021YFC2302603, NSFC No. 32070924 및 32000651, 충칭 자연 과학 재단 프로젝트 프로그램의 No. 2019jcyjA-msxmx0159의 지원을 받았습니다.

동물실험은 실험동물의 사용과 관리에 관한 매뉴얼에 의거하여 실시하였으며, 제3군의과대학 실험동물복지윤리위원회의 승인을 받았다. 6-8주령의 암컷 Balb/c 마우스를 본 연구에 사용했습니다. 동물들은 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료 표 참조).
1. MRSA HI 항원 단백질의 제조
<ol><li>상업적 소스에서 IsdB 및 Hla 클론을 얻고(재료 표 참조), 중...

<ol>
	<li>Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+and+virulence+of+Staphylococcus+aureus.">Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus.</a> Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).</li><li>Lakhundi, S., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus:+molecular+characterization,+evolution,+and+epidemiology.">Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology.</a> Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).</li><li>Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+antibiotic+resistance:+the+most+critical+pathogens.">Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens.</a> Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).</li><li>Goull&#233;, J. P., Grangeot-Keros, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aluminum+and+vaccines:+Current+state+of+knowledge.">Aluminum and vaccines: Current state of knowledge.</a> Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+adjuvants:+Understanding+the+structure+and+mechanism+of+adjuvanticity.">Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity.</a> Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).</li><li>Geoghegan, S., O'Callaghan, K. P., Offit, P. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+and+efficacy+of+MF59-adjuvanted+vaccines.">Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).</li><li>Chen, B. H., Inbaraj, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion+and+nanoliposome+based+strategies+for+improving+anthocyanin+stability+and+bioavailability.">Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability.</a> Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).</li><li>Zuo, Q. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+protective+immunity+of+a+novel+subunit+fusion+vaccine+in+a+murine+model+of+systemic+MRSA+infection.">Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection.</a> PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).</li><li>Sun, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immunity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+infection+by+a+novel+nanoemulsion+adjuvant+vaccine.">Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).</li><li>National Pharmacopoeia Committee. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chinese Pharmacopoeia. , 1088 (2020).</li><li>Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+nanoindentation+method+on+collagen+fibrils.">Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils.</a> Materials. 15 (7), 2477 (2022).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunodominant+epitope-specific+monoclonal+antibody+cocktail+improves+survival+in+a+mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+bacteremia.">An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia.</a> The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).</li><li>Roy, U., Kornitzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme-iron+acquisition+in+fungi.">Heme-iron acquisition in fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).</li><li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+toxins+in+musculoskeletal+infections.">Bacterial toxins in musculoskeletal infections.</a> Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).</li><li>Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+in+vivo+evaluation+of+baicalin-loaded+W/O+nanoemulsion+for+lymphatic+absorption.">Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption.</a> Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).</li><li>Singh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion:+Concepts,+development+and+applications+in+drug+delivery.">Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).</li><li>Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+modeling+and+experimental+validation+of+nanoemulsion-based+drug+transport+across+cellular+barriers.">Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers.</a> Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).</li><li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLS+and+zeta+potential-What+they+are+and+what+they+are+not.">DLS and zeta potential-What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li><li>Francis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+vaccine+technologies.">Recent advances in vaccine technologies.</a> The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).</li><li>Tripathi, N. K., Shrivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+recombinant+protein-based+dengue+vaccines.">Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).</li><li>Wilder-Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+vaccine+development:+status+and+future.">Dengue vaccine development: status and future.</a> Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).</li><li>Korneev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+sepsis+and+septic+shock.">Mouse models of sepsis and septic shock.</a> Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).</li></ol>

박테리아 세포벽 고정 및 철 조절 표면 단백질인 IsdB는 헴철15를 얻는 과정에서 중요한 역할을 합니다. 알파 독소인 HLA는 MRSA에서 알려진 가장 효과적인 박테리아 독소 중 하나이며, 진핵 세포에 기공을 형성하고 부착 및 상피 세포를 방해할 수 있다16. 본 연구에서는 IsdB와 Hla의 항원 유전자를 기반으로 한 유전자 공학 기술로 새로운 ?...

메티실린 내성 황색포도 상구균 (MRSA)은 전 세계 중환자실(ICU) 병동1, 심장내과 및 화상 부서에서 감염률이 가장 높은 기회 병원체 중 하나입니다. MRSA는 높은 감염률, 사망률 및 광범위한 약물 내성을 나타내어 임상 치료에 큰 어려움을 나타냅니다2. 2017년 세계보건기구(WHO)가 발표한 항생제 내성 박테리아의 글로벌 우선순위 목록에서 MRSA는 가장 중요한 범주3에 포함되었습니다. 따라서 MRSA 감염에 대한 백신이 시급히 필요합니다.
알루미늄 보조제는 오랫동안 사용되어 왔으며 보조제 보조 메커니즘은 비교적 명확하고 안전하며 효과적이며 내약성이 우수합니다4. 알루미늄 보조제는 현재 널리 사용되는 보조제 유형입니다. 일반적으로 알루미늄염 입자에 흡착된 항원은 안정성을 향상시키고 주사 부위의 항원 흡수 능력을 향상시켜 우수한 흡수와 느린 방출을 제공할 수 있다고 믿어진다5. 현재, 알루미늄 보조제의 주요 단점은 일부 백신 후보 항원에 대해 보조제 효과가 없거나 약한 보조제 효과만을 나타낸다는 것이다6. 또한, 알루미늄 보조제는 IgE 매개 과민 반응을 유도한다5. 따라서 더 강한 면역 반응을 자극하기 위해 새로운 보조제를 개발할 필요가 있습니다.
나노에멀젼 보조제는 오일, 물, 계면활성제 및 공계면활성제로 구성된 콜로이드 분산 시스템이다7. 또한, 보조제는 열역학적으로 안정하고 등방성이며, 고속 원심분리에 의해 오토클레이브 또는 안정화될 수 있고, 온화한 제조 조건 하에서 자발적으로 형성될 수 있다. 여러 에멀젼 보조제(예: MF59, NB001-002 시리즈, AS01-04 시리즈 등)가 현재 시판 중이거나 임상 연구 단계에 있지만 입자 크기는 160nm8보다 큽니다. 따라서 나노 스케일 (1-100 nm) 의약품의 장점 (즉, 큰 비 표면적, 작은 입자 크기, 표면 효과, 높은 표면 에너지, 작은 크기 효과 및 매크로 양자 터널링 효과)을 완전히 활용할 수 없습니다. 본 프로토콜에서, 직경 크기가 1-100 nm인 나노에멀젼 기술에 기초한 신규한 보조제는 양호한 보조제 활성을 나타내는 것으로 보고되었다9. 재조합 서브유닛 백신 항원 단백질 HI (α-hemolysin 돌연변이체[Hla] 및 Fe 이온 표면 결정 인자 B[IsdB] 서브유닛 N2 활성 단편 융합 단백질)를 시험하였다. 마우스 전신 감염 모델을 사용하여 물리적 특성과 안정성을 검사하고, 근육 투여 후 특정 항체 반응을 평가하고, 백신의 보호 효과를 테스트하기 위한 일련의 절차가 수립되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5424000495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated, USA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Dimension FastScan</td>
			<td>BRUKER, Germany&#160;</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol lamp</td>
			<td>Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China</td>
			<td>YBS-AA-11408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c mice&#160;</td>
			<td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China</td>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad 6.0 microplate reader</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Competent Cell</td>
			<td>Merck millipore,Germany</td>
			<td>70232-3CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-100G</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>B2064-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie bright blue G-250 staining solution</td>
			<td>MIKX,China</td>
			<td>DB236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decolorization solution</td>
			<td>BOSTER,China</td>
			<td>AR0163-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420</td>
			<td>Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing Liuyi Instrument Factory, China</td>
			<td>DYCZ-25D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel image</td>
			<td>Tanon, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione-Sepharose Resin GST</td>
			<td>Mei5bio,China</td>
			<td>affinity chromatography resin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China</td>
			<td>7664-93-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI recombinant protein</td>
			<td>Third Military Medical University,China</td>
			<td>110-27-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP -Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG1</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03002R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03003R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP- Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td>Biodragon, China</td>
			<td>BF03004R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Haimen Feiyue Co.,LTD,China</td>
			<td>YR-JZH-1UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsdB and Hla clones</td>
			<td>Shanghai Jereh Biotechnology Co,China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl- &#946;-D-1-mercaptogalactopyranoside</td>
			<td>fdbio,China</td>
			<td>FD3278-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB bouillon culture-medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lnfrared physiotherapy lamp</td>
			<td>Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China</td>
			<td>7600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern NANO ZS</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd., UK</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MH(A) medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MH(B) medium</td>
			<td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td>
			<td>02-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro plate washing machine 405 LSRS</td>
			<td>Bio Tek Instruments,Inc Highland&#160; Park,USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument</td>
			<td>BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMC packing</td>
			<td>TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD</td>
			<td>0022818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRSA252</td>
			<td>USA, ATCC</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit</td>
			<td>DAKEWE, China</td>
			<td>8012011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>biosharp, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR, Amplifier</td>
			<td>Thermal Cycler, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-target gene recombinant plasmid</td>
			<td>Shanghai Jereh Biotechnology Co,China</td>
			<td>B3528G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>G-CLONE, China</td>
			<td>CS1231-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>3120000844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>K400327-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera</td>
			<td>null</td>
			<td>See Reference 11 for details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propylene glycol (pharmaceutic adjuvant)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>P4347-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Thermo Scientufuc, USA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF TRANSFER MEMBRANE</td>
			<td>Invitrogen,USA</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>JEOL,Japan</td>
			<td>JSM-IT800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Merck,Germany</td>
			<td>Tc-P8411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos L120C TEM</td>
			<td>Thermo Fisher, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB color solution</td>
			<td>TIAN GEN, China</td>
			<td>PA107-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turtle kits</td>
			<td>Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD</td>
			<td>ES80545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Macklin, China</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating the immune response of a nanoemulsion adjuvant vaccine against methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) infection

나노 에멀젼 보조 백신은 작은 입자 크기, 높은 열 안정성 및 유효한 면역 반응을 유도하는 능력으로 인해 광범위한 관심을 끌었습니다. 그러나 새로운 나노에멀젼 보조제 백신의 면역 반응을 평가하기 위한 일련의 포괄적인 프로토콜을 수립하는 것이 중요합니다. 따라서 이 기사에서는 백신의 물리화학적 특성(투과전자현미경[TEM], 원자력현미경[AFM] 및 동적 광산란[DLS]), 백신 항원 및 시스템의 안정성(고속 원심분리기 테스트, 열역학적 안정성 테스트, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯) 및 특정 면역 반응(IgG1, IgG2a 및 IgG2b). 이 접근법을 사용하여 연구자들은 치명적인 MRSA252 마우스 모델에서 새로운 나노 에멀젼 보조 백신의 보호 효과를 정확하게 평가할 수 있습니다. 이러한 프로토콜을 통해 효과적인 보조제 잠재력 측면에서 가장 유망한 나노에멀젼 백신 보조제를 확인할 수 있습니다. 또한 이 방법은 향후 개발을 위해 새로운 백신을 최적화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

나노에멀젼 아쥬반트 백신을 제조하기 위한 프로토콜과 이 백신의 시험관내 및 생체내 시험이 평가되었다. TEM, AFM 및 DLS를 사용하여 이 샘플 표면의 제타 전위 및 입자 크기의 중요한 특성을 확인했습니다(그림 1). SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏팅은 침전물 및 상청액 내의 항원의 양이 원심분리 후에도 유의하게 분해되지 않았음을 보여주었으며, 이는 백신이 구조적으?...

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Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus MRSA Infection

본 프로토콜은 새로운 나노에멀젼 보조제 백신의 물리적 특성, 면역 반응 및 생체 내 보호 효과를 준비하고 평가합니다.

메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA) 감염에 대한 나노에멀젼 보조제 백신의 면역 반응 평가

Nanoemulsion adjuvant vaccines have attracted extensive attention because of their small particle size, high thermal stability, and ability to induce ...

입증된 프로토콜은 직접적이고 효과적인 실험적 접근 방식과 새로운 바이러스 보조제의 면역 반응 효과에 대한 세부 단계를 강조했습니다. 이 프로토콜은 보조 백신에 대한 기본적인 면역 평가 방법을 연구에 제공할 뿐만 아니라 질량 안정성을 결정할 수도 있습니다. 먼저, MRSA HI 항원 단백질의 10 밀리리터 작업 용액을 취하고, 여기에 이소프로필 미리스테이트, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 프로필렌 글리콜 등 3가지 부형제를 순차적으로 첨가하고, 1 대 6 대 3의 질량비를 유지한다.혼합물을 잘 저어 준 다음 멸균 된 순수한 물을 서서히 첨가하여 10 밀리리터의 시스템 부피에 도달하십시오. 저에너지 유화법으로 나노에멀젼 백신을 제조하기 위해서는 분당 500회전, 섭씨 25도에서 약 20분 동안 교반한다. 이어서, 밀리리터 당 1 밀리그램의 단백질을 함유하는 나노 에멀젼 백신을 투명한 액체로서 수득한다.효소 결합 면역흡착 분석 또는 ELISA 플레이트의 항원 코팅을 위해, HI 단백질 항원을 코팅 용액으로 밀리리터당 10마이크로그램으로 희석하고, 웰당 희석된 항원 100마이크로리터를 ELISA 플레이트에 첨가한다. 접시를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 인큐베이션 후, 플레이트를 웰 당 300 마이크로리터의 PBST로 세척한다.웰 당 300 마이크로리터의 밀봉 용액으로 웰을 섭씨 37도에서 2시간 동안 밀봉한 후, 각 실험군으로부터 3 마이크로리터의 마우스 혈청을 297 마이크로리터의 PBST를 첨가하여 100배 희석하고, 희석된 혈청을 와동시킨다. 각 혈청 샘플에 대해 코팅된 ELISA 플레이트에 웰당 100마이크로리터의 희석된 혈청을 추가합니다. 유사하게, 396 마이크로리터의 PBST에 4 마이크로리터의 양성 또는 음성 대조군 혈청을 첨가하여 PBST로 양성 및 음성 대조군 혈청을 100배 희석한 다음, 와류 혼합한다.이중 비율 희석을 수행하려면 이전에 희석된 실험 혈청 200마이크로리터를 코팅된 ELISA 플레이트의 첫 번째 행에 추가한 다음 1열과 12행의 웰을 제외한 모든 웰에 PBST 100마이크로리터를 추가합니다. 다음으로, 피펫 건을 100 마이크로리터로 조정하고 100 마이크로리터의 혈청을 첫 번째 행에서 PBST가 포함된 두 번째 행으로 옮깁니다. 피펫 건을 사용하여 두 번째 줄의 내용물을 10 번 혼합하십시오.유사하게, 1행까지 혈청을 2회 연속적으로 희석하여 11행을 수행한다. 완료되면 100열에서 11마이크로리터의 액체를 버립니다. 100마이크로리터의 희석된 음성 및 양성 혈청을 샘플 템플릿에 따라 행 12의 각 해당 웰에 추가합니다.ELISA 플레이트를 플라스틱 랩으로 밀봉하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 한편, PBST를 첨가하여 2차 항체 anti-mouse IgG HRP를 10, 000배 희석한다. 1시간 배양 후, 웰 당 300 마이크로리터의 PBST로 ELISA 플레이트를 세척하여 결합되지 않은 항체를 세척한 다음, 희석된 2차 항체 100 마이크로리터를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 섭씨 37도에서 40분 동안 인큐베이션한다.웰 당 300 마이크로리터의 PBST로 플레이트를 세척한 다음, 100 마이크로리터의 TMB 발색 용액을 각 웰에 첨가한다. 접시를 섭씨 37도에 놓고 10분 동안 빛을 피하십시오. 그 후, 50 마이크로 리터의 2 몰 황산으로 즉시 반응을 종결시킨다.종료 후 15분 이내에 효소 마커를 사용하여 415나노미터에서 광학 밀도 또는 OD 값을 감지합니다. 새로운 나노 에멀젼 백신의 물리적 특성은 투과 전자 현미경과 원자력 현미경을 사용하여 분석되었습니다. 동적 광 산란은 샘플의 입자 크기 분포와 제타 전위를 결정하는 데 사용되었습니다.SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅은 침전물 및 상청액 중의 항원의 양이 원심분리 후 유의하게 지연되지 않았으며, 이는 백신이 구조적으로 손상되지 않고 특이적이며 면역원성임을 나타냅니다. 나노에멀젼 아쥬반트 백신은 마우스의 총 IgG, IgG1 및 IgG2a 항체 역가를 유의하게 증가시켰다. 단백질 백신의 면역원성이 현저히 개선되었다.450 나노미터에서의 혈청 IgG2b OD 값은 PBS가 5, 000 희석 정도일 때 가장 높았다. MRSA 252 마우스의 치명적인 모델은 나노 에멀젼 백신이 우수한 보호 효과를 나타내고 MRS A 252에 의한 박테리아 감염을 효과적으로 억제하여 감염된 마우스의 생존율을 향상 시킨다는 것을 반영했다. 나노 유화의 준비와 식물에 혈청을 첨가하는 것이 가장 중요합니다.또한, 항체 역가를 검출하는 곳에서는 더 넓고 액체계 아웃으로 보정하는 데 주의를 기울여야 한다. 보조제 외에도 이 방법은 플라스틱이나 전달 시스템과 같은 다른 수학 배열의 면역 진화에도 사용할 수 있습니다.