Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Здесь мы демонстрируем оптимизированный протокол на основе флуоресценции BODIPY 493/503 для характеристики липидных капель в ткани печени. Благодаря использованию ортогональных проекций и 3D-реконструкций флуорофор позволяет успешно различать микровезикулярный и макровезикулярный стеатоз и может представлять собой дополнительный подход к классическим гистологическим протоколам оценки стеатоза печени.
Липидные капли (LD) представляют собой специализированные органеллы, которые опосредуют накопление липидов и играют очень важную роль в подавлении липотоксичности и предотвращении дисфункции, вызванной свободными жирными кислотами (FA). Печени, учитывая ее критическую роль в жировом обмене организма, постоянно угрожает внутриклеточное накопление ЛД в виде как микровезикулярного, так и макровезикулярного стеатоза печени. Гистологическая характеристика LD обычно основана на жирорастворимых диазокрасителях, таких как окрашивание Oil Red O (ORO), но ряд недостатков постоянно препятствует использованию этого анализа с образцами печени. Совсем недавно липофильные флуорофоры 493/503 стали популярными для визуализации и определения местоположения LD из-за их быстрого поглощения и накопления в нейтральном ядре липидных капель. Несмотря на то, что большинство применений хорошо описаны в клеточных культурах, существует меньше доказательств, демонстрирующих надежное использование липофильных флуорофорных зондов в качестве инструмента визуализации LD в образцах тканей. Здесь мы предлагаем оптимизированный протокол на основе дипиррометена бора (BODIPY) 493/503 для оценки LD в образцах печени из животной модели стеатоза печени, вызванного диетой с высоким содержанием жиров (HFD). Этот протокол охватывает подготовку образцов печени, срезы тканей, окрашивание BODIPY 493/503, получение изображений и анализ данных. Мы демонстрируем увеличение количества, интенсивности, соотношения площадей и диаметра печеночных ЛД при кормлении HFD. Используя ортогональные проекции и 3D-реконструкции, можно было наблюдать полное содержание нейтральных липидов в ядре LD, которые выглядели почти сферическими каплями. Кроме того, с помощью флуорофора BODIPY 493/503 мы смогли различить микровезикулы (1 мкм < d ≤ 3 мкм), промежуточные везикулы (3 мкм < d ≤ 9 мкм) и макровезикулы (d > 9 мкм), что позволило успешно различать микровезикулярный и макровезикулярный стеатоз. В целом, этот протокол BODIPY 493/503 на основе флуоресценции является надежным и простым инструментом для характеристики ЛД печени и может представлять собой дополнительный подход к классическим гистологическим протоколам.
Липидные капли (ЛД), классически рассматриваемые как энергетические депо, представляют собой специализированные клеточные органеллы, которые опосредуют накопление липидов, и они составляют гидрофобное нейтральное липидное ядро, которое в основном содержит сложные эфиры холестерина и триглицериды (ТГ), инкапсулированные фосфолипидным монослоем 1,2,3.
Биогенез ЛД происходит в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), начиная с синтеза триацилглицерина (ТАГ) и эфиров стерола. Нейтральные липиды диффундируют между листочками бислоя ER в низких концентрациях, но сливаются в масляные линзы, которые растут и превращаются в почти сферические капли из мембраны ER, когда их внутриклеточная концентрация увеличивается4. Впоследствии белки из бислоя ER и цитозоля, особенно семейства белков перилипина (PLIN), перемещаются на поверхности LD, чтобы облегчить почкование 5,6,7,8,9.
Благодаря синтезу новых жирных кислот и слиянию или слиянию LD LD вырастают до разных размеров. Соответственно, размер и количество LD значительно различаются в разных типах клеток. Мелкие капли (диаметром 300-800 нм), известные как начальные LD (iLDs), могут образовываться почти всеми клетками4. Позже при образовании LD большинство клеток способны превращать некоторые iLD в более крупные, расширяющиеся LD (eLDs >1 мкм в диаметре). Тем не менее, только определенные типы клеток, такие как адипоциты и гепатоциты, обладают способностью образовывать гигантские или сверхбольшие LD (до десятков микрон в диаметре)4,10.
ЛД играют очень важную роль в регуляции клеточного липидного обмена, подавляя липотоксичность и предотвращая стресс ER, митохондриальную дисфункцию и, в конечном итоге, гибель клеток, вызванную свободными жирными кислотами (ЖК)11,12,13,14. Кроме того, LD также участвуют в регуляции экспрессии генов, секвестрации белка репликации вируса, а также мембранного трафика и передачи сигналов15,16,17. Таким образом, нарушение регуляции биогенеза ЛД является отличительной чертой хронических заболеваний, связанных с метаболическим синдромом, ожирением, сахарным диабетом 2 типа (СД2) и/или атеросклерозом, и это лишь некоторые из них18,19,20.
Печень, как метаболический центр, в основном отвечает за липидный обмен путем хранения и переработки липидов, и, следовательно, ей постоянно угрожает липотоксичность21. Стеатоз печени (ГС) является общим признаком ряда прогрессирующих заболеваний печени и характеризуется чрезмерным внутриклеточным накоплением липидов в виде цитозольных ЛД, что, в конечном итоге, может привести к метаболической дисфункции печени, воспалению и запущенным формам неалкогольной жировой болезни печени22,23,24,25. HS возникает, когда скорость окисления и экспорта жирных кислот в виде триглицеридов в липопротеинах очень низкой плотности (ЛПОНП) ниже, чем скорость поглощения жирных кислот печенью из плазмы и синтеза жирных кислот de novo 26. Накопление липидов в печени часто происходит в двух формах - микровезикулярном и макровезикулярном стеатозе - и они проявляют различные цитоархитектонические характеристики27. Как правило, микровезикулярный стеатоз характеризуется наличием небольших ЛД, рассеянных по всему гепатоциту с центральным расположением ядра, тогда как макровезикулярный стеатоз характеризуется наличием одного большого ЛД, который занимает большую часть гепатоцита, выталкивая ядро на периферию28,29. Примечательно, что эти два типа стеатоза часто встречаются вместе, и остается неясным, как эти два паттерна LD влияют на патогенез заболевания, поскольку доказательства все еще противоречивы31,32,33,34. Тем не менее, такой тип анализа часто используется в качестве «эталонного стандарта» в доклинических и клинических исследованиях для понимания динамического поведения LD и характеристики стеатоза печени 29,34,35,36.
Биопсия печени, золотой стандарт диагностики и классификации ГС, обычно оценивается с помощью гистологического анализа гематоксилина и эозина (H & E), где липидные капли оцениваются как неокрашенные вакуоли в окрашенных H&E срезахпечени 37. Хотя этот тип окрашивания приемлем для оценки макровезикулярного стеатоза, он обычно сужает оценку микровезикулярного стеатоза38. Жирорастворимые диазокрасители, такие как Oil Red O (ORO), классически комбинируют с светлопольной микроскопией для анализа внутриклеточных запасов липидов, но они все еще имеют ряд недостатков: (i) использование этанола или изопропанола в процессе окрашивания, что часто вызывает разрушение нативных LD и случайное слияние, несмотря на то, что клетки фиксируются39; (ii) трудоемкий характер, поскольку раствор ORO требует растворения и фильтрации свежего порошка из-за ограниченного срока годности, что способствует менее стабильным результатам; (iii) и тот факт, что ORO окрашивает не только липидные капли, но и часто переоценивает стеатоз печени38.
Следовательно, проницаемые для клеток липофильные флуорофоры, такие как нильский красный, использовались либо в живых, либо в фиксированных образцах для преодоления некоторых из вышеупомянутых ограничений. Однако неспецифический характер маркировки клеточных липидных органелл неоднократно сужает оценки ЛД40. Кроме того, спектральные свойства Nile Red изменяются в зависимости от полярности окружающей среды, что часто может приводить к спектральным сдвигам41.
Липофильный флуоресцентный зонд 1,3,5,7,8-пентаметил-4-бора-3а,4адиаза-с-индацен (длина волны возбуждения: 480 нм; максимум излучения: 515 нм; BODIPY 493/503) проявляет характеристики гидрофобности, которые позволяют быстро поглощать его внутриклеточными ЛД, накапливается в ядре липидных капель и, впоследствии, испускает ярко-зеленую флуоресценцию12. В отличие от Nile Red, BODIPY 493/503 нечувствителен к полярности окружающей среды и, как было показано, более селективен, поскольку он демонстрирует высокую яркость для визуализации LD. Для окрашивания нейтральных LD этот краситель можно использовать в живых или фиксированных клетках и успешно сочетать с другими методами окрашивания и/или маркировки42. Еще одним преимуществом красителя является то, что он не требует особых усилий для помещения в раствор и является стабильным, что устраняет необходимость в его свежем приготовлении для каждого эксперимента42. Несмотря на то, что зонд BODIPY 493/503 был успешно использован для визуализации локализации и динамики LD в клеточных культурах, в некоторых отчетах также продемонстрировано надежное использование этого красителя в качестве инструмента визуализации LD в тканях, включая латеральную мышцу43 человека, камбаловидную мышцу 42 крысы и кишечник44 мыши.
Здесь мы предлагаем оптимизированный протокол на основе BODIPY 493/503 в качестве альтернативного аналитического подхода для оценки числа, площади и диаметра LD в образцах печени из животной модели стеатоза печени. Эта процедура охватывает подготовку образцов печени, срез тканей, условия окрашивания, получение изображений и анализ данных.
Все процедуры на животных, выполненные в этом исследовании, были одобрены Коимбрским институтом клинических и биомедицинских исследований (iCBR) и Органом по защите животных (ORBEA, #9/2018) и соответствовали национальным и европейским директивам по уходу за животными, а также рекомендациям ARRIVE.
1. Экспериментальный дизайн
2. Подготовка образцов печени
3. Секция замороженных тканей
4. Окрашивание BODIPY
5. Количественная оценка липидов
6. Получение изображения
7. Анализ изображений
8. Статистический анализ
Успешное выполнение этого метода должно привести к четкому окрашиванию липидных капель для одновременной характеристики морфологии LD (форма и плотность липидного ядра на основе 3D-реконструкции) вместе с их пространственным распределением, количеством на общую площадь и средним разм?...
Этот протокол BODIPY 493/503 на основе флуоресценции для оценки LD был направлен на разработку нового подхода к визуализации для оценки стеатоза печени. Учитывая сильную корреляцию между ожирением и жировой болезнью печени, диета с высоким содержанием жиров в западном стиле была использован?...
Авторам раскрывать нечего.
Это исследование финансировалось национальными и европейскими фондами через Португальский научно-технический фонд (FCT), Европейский фонд регионального развития (FEDER) и Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) и POCI-01-0145-FEDER-007440. Авторы хотели бы поблагодарить за поддержку iLAB - Лабораторию микроскопии и биовизуализации, учреждение медицинского факультета Университета Коимбры и члена национальной инфраструктуры PPBI-Португальская платформа биовизуализации (POCI-01-0145-FEDER-022122), а также поддержку со стороны FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set | Fisher Scientific | ||
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
70% ethanol | Honeywell | 10191455 | |
Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
Automatic analyzer Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
Blade | Leica | 221052145 | Used in the cryostat |
Cell Profiler version 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | Used to analyse the acquired images | |
Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
Dry ice container (styrofoam cooler) | Novolab | A26742 | |
Dumont forceps | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) | Thermo Scientific | 150318 | Used to weigh the liver after dissection |
Glycergel | DAKO Omnis | S303023 | |
GraphPad Prism software, version 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
High-fat diet | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
Ketamine (Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | Used at a final concentration of 75 mg/kg |
Laser scanning confocal microscope (QUASAR detection unit; ) | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 microscope | |
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | Used at a final concentration of 1 mg/kg |
Needle | BD microlance | 300635 | |
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade | Swann-Morton | 205 | |
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, Germany | ||
Paint brushes | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections | |
Peristaltic pump (Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
Slide staining system StainTray | Simport Scientific | M920 | |
Standard diet | Mucedola | 4RF21 | |
Superfrost Plus microscope slides | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
Tissue-Tek OCT mounting media | VWR CHEMICALS | 361603E | |
Triglycerides colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 10010303 | |
Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge | Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
ZEN Black software | Zeiss |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены