Анализ флуоресцентно окрашенных липидных капель с 3D-реконструкцией для оценки стеатоза печени

Липидные капли (LD) представляют собой специализированные органеллы, которые опосредуют накопление липидов и играют очень важную роль в подавлении липотоксичности и предотвращении дисфункции, вызванной свободными жирными кислотами (FA). Печени, учитывая ее критическую роль в жировом обмене организма, постоянно угрожает внутриклеточное накопление ЛД в виде как микровезикулярного, так и макровезикулярного стеатоза печени. Гистологическая характеристика LD обычно основана на жирорастворимых диазокрасителях, таких как окрашивание Oil Red O (ORO), но ряд недостатков постоянно препятствует использованию этого анализа с образцами печени. Совсем недавно липофильные флуорофоры 493/503 стали популярными для визуализации и определения местоположения LD из-за их быстрого поглощения и накопления в нейтральном ядре липидных капель. Несмотря на то, что большинство применений хорошо описаны в клеточных культурах, существует меньше доказательств, демонстрирующих надежное использование липофильных флуорофорных зондов в качестве инструмента визуализации LD в образцах тканей. Здесь мы предлагаем оптимизированный протокол на основе дипиррометена бора (BODIPY) 493/503 для оценки LD в образцах печени из животной модели стеатоза печени, вызванного диетой с высоким содержанием жиров (HFD). Этот протокол охватывает подготовку образцов печени, срезы тканей, окрашивание BODIPY 493/503, получение изображений и анализ данных. Мы демонстрируем увеличение количества, интенсивности, соотношения площадей и диаметра печеночных ЛД при кормлении HFD. Используя ортогональные проекции и 3D-реконструкции, можно было наблюдать полное содержание нейтральных липидов в ядре LD, которые выглядели почти сферическими каплями. Кроме того, с помощью флуорофора BODIPY 493/503 мы смогли различить микровезикулы (1 мкм < d ≤ 3 мкм), промежуточные везикулы (3 мкм < d ≤ 9 мкм) и макровезикулы (d > 9 мкм), что позволило успешно различать микровезикулярный и макровезикулярный стеатоз. В целом, этот протокол BODIPY 493/503 на основе флуоресценции является надежным и простым инструментом для характеристики ЛД печени и может представлять собой дополнительный подход к классическим гистологическим протоколам.