Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Здесь мы демонстрируем оптимизированный протокол на основе флуоресценции BODIPY 493/503 для характеристики липидных капель в ткани печени. Благодаря использованию ортогональных проекций и 3D-реконструкций флуорофор позволяет успешно различать микровезикулярный и макровезикулярный стеатоз и может представлять собой дополнительный подход к классическим гистологическим протоколам оценки стеатоза печени.

Abstract

Липидные капли (LD) представляют собой специализированные органеллы, которые опосредуют накопление липидов и играют очень важную роль в подавлении липотоксичности и предотвращении дисфункции, вызванной свободными жирными кислотами (FA). Печени, учитывая ее критическую роль в жировом обмене организма, постоянно угрожает внутриклеточное накопление ЛД в виде как микровезикулярного, так и макровезикулярного стеатоза печени. Гистологическая характеристика LD обычно основана на жирорастворимых диазокрасителях, таких как окрашивание Oil Red O (ORO), но ряд недостатков постоянно препятствует использованию этого анализа с образцами печени. Совсем недавно липофильные флуорофоры 493/503 стали популярными для визуализации и определения местоположения LD из-за их быстрого поглощения и накопления в нейтральном ядре липидных капель. Несмотря на то, что большинство применений хорошо описаны в клеточных культурах, существует меньше доказательств, демонстрирующих надежное использование липофильных флуорофорных зондов в качестве инструмента визуализации LD в образцах тканей. Здесь мы предлагаем оптимизированный протокол на основе дипиррометена бора (BODIPY) 493/503 для оценки LD в образцах печени из животной модели стеатоза печени, вызванного диетой с высоким содержанием жиров (HFD). Этот протокол охватывает подготовку образцов печени, срезы тканей, окрашивание BODIPY 493/503, получение изображений и анализ данных. Мы демонстрируем увеличение количества, интенсивности, соотношения площадей и диаметра печеночных ЛД при кормлении HFD. Используя ортогональные проекции и 3D-реконструкции, можно было наблюдать полное содержание нейтральных липидов в ядре LD, которые выглядели почти сферическими каплями. Кроме того, с помощью флуорофора BODIPY 493/503 мы смогли различить микровезикулы (1 мкм < d ≤ 3 мкм), промежуточные везикулы (3 мкм < d ≤ 9 мкм) и макровезикулы (d > 9 мкм), что позволило успешно различать микровезикулярный и макровезикулярный стеатоз. В целом, этот протокол BODIPY 493/503 на основе флуоресценции является надежным и простым инструментом для характеристики ЛД печени и может представлять собой дополнительный подход к классическим гистологическим протоколам.

Introduction

Липидные капли (ЛД), классически рассматриваемые как энергетические депо, представляют собой специализированные клеточные органеллы, которые опосредуют накопление липидов, и они составляют гидрофобное нейтральное липидное ядро, которое в основном содержит сложные эфиры холестерина и триглицериды (ТГ), инкапсулированные фосфолипидным монослоем 1,2,3.

Биогенез ЛД происходит в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), начиная с синтеза триацилглицерина (ТАГ) и эфиров стерола. Нейтральные липиды диффундируют между листочками бислоя ER в низких концентрациях,....

Protocol

Все процедуры на животных, выполненные в этом исследовании, были одобрены Коимбрским институтом клинических и биомедицинских исследований (iCBR) и Органом по защите животных (ORBEA, #9/2018) и соответствовали национальным и европейским директивам по уходу за животными, а также рекомендациям ARR.......

Representative Results

Успешное выполнение этого метода должно привести к четкому окрашиванию липидных капель для одновременной характеристики морфологии LD (форма и плотность липидного ядра на основе 3D-реконструкции) вместе с их пространственным распределением, количеством на общую площадь и средним разм?.......

Discussion

Этот протокол BODIPY 493/503 на основе флуоресценции для оценки LD был направлен на разработку нового подхода к визуализации для оценки стеатоза печени. Учитывая сильную корреляцию между ожирением и жировой болезнью печени, диета с высоким содержанием жиров в западном стиле была использован?.......

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgements

Это исследование финансировалось национальными и европейскими фондами через Португальский научно-технический фонд (FCT), Европейский фонд регионального развития (FEDER) и Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) и POCI-01-0145-FEDER-007440. Авторы хотели бы поблагодарить за поддержку iLAB - Лабораторию микроскопии и биовизуализации, учреждение медицинского факультета Университета Коимбры и члена национальной инфраструктуры PPBI-Португальская платформа биовизуализации (POCI-01-0145-FEDER-022122), а также поддержку со стороны FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip setFisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)Sigma-Aldrich, Lyon, FranceD3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, ORD1306
70% ethanolHoneywell10191455
Adobe Illustrator CCAdobe Inc.Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)Daido Sangyo Co., Ltd, Japon_
BladeLeica221052145Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5https://cellprofiler.org/releases/Used to analyse the acquired images
CoverslipsMenzel-Glaser, Germany_
CryomoldsTissue-Tek_
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 SLeica Biosystems_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich, Lyon, FranceD-8418Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic
and flammable. Vapors may cause
irritation. Manipulate in a fume
hood. Avoid direct contact with skin.
Wear rubber gloves, protective eye
goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler)NovolabA26742
Dumont forcepsFine Science Tools, Germany11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø
150 mm)
Thermo Scientific150318Used to weigh the liver after dissection
GlycergelDAKO OmnisS303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat dietEnvigo, Barcelona, SpainMD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)Dechra791/01/14DFVPTUsed at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; )Carl Zeiss, germanyLSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)Dechra1838 ESP / 020/01/07RFVPTUsed at a final concentration of 1 mg/kg
NeedleBD microlance300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel
Blade
Swann-Morton205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) Carl Zeiss, Germany
Paint brushesVan Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3)Gilson1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)Sigma-Aldrich, Lyon, FranceP3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3Swann-Morton0208
Slide staining system StainTraySimport ScientificM920
Standard diet Mucedola4RF21
Superfrost Plus microscope slidesMenzel-Glaser, GermanyJ1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting mediaVWR CHEMICALS361603E
Triglycerides colorimetric assay kitCayman Chemical10010303
Ultrasonic bathBandelin Sonorex TK 52
Vannas spring scissors - 3 mm
cutting edge
Fine Science Tools, Germany15000-00
ZEN Black softwareZeiss

References

  1. Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
  2. Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

196BODIPY 493 503

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved