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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Um pipeline experimental para descrever quantitativamente o padrão locomotor de camundongos que caminham livremente usando a caixa de ferramentas MouseWalker (MW) é fornecido, variando de gravações de vídeo iniciais e rastreamento até análise pós-quantificação. Um modelo de lesão por contusão medular em camundongos é empregado para demonstrar a utilidade do sistema MW.

Abstract

A execução de programas motores complexos e de alta coordenação, como caminhada e corrida, é dependente da ativação rítmica dos circuitos espinhal e supra-espinhal. Após uma lesão medular torácica, a comunicação com os circuitos a montante é prejudicada. Isso, por sua vez, leva a uma perda de coordenação, com potencial de recuperação limitado. Assim, para melhor avaliar o grau de recuperação após a administração de fármacos ou terapias, há necessidade de novas ferramentas, mais detalhadas e precisas, para quantificar a marcha, a coordenação dos membros e outros aspectos finos do comportamento locomotor em modelos animais de lesão medular. Vários ensaios foram desenvolvidos ao longo dos anos para avaliar quantitativamente o comportamento de marcha livre em roedores; no entanto, eles geralmente carecem de medidas diretas relacionadas a estratégias de marcha escalonada, padrões de pegadas e coordenação. Para resolver essas deficiências, uma versão atualizada do MouseWalker, que combina uma passarela de reflexão interna total frustrada (fTIR) com software de rastreamento e quantificação, é fornecida. Este sistema de código aberto foi adaptado para extrair várias saídas gráficas e parâmetros cinemáticos, e um conjunto de ferramentas de pós-quantificação pode ser para analisar os dados de saída fornecidos. Este manuscrito também demonstra como esse método, aliado a testes comportamentais já estabelecidos, descreve quantitativamente déficits locomotores após lesão medular.

Introduction

A coordenação efetiva dos quatro membros não é exclusiva dos animais quadrúpedes. A coordenação membro torácico-membro pélvico em humanos continua sendo importante para a realização de diversas tarefas, como natação e alterações da velocidade durante amarcha1. Vários programascinemáticos e motoresdos membros2,3,4, bem como circuitos de feedback proprioceptivo5, são conservados entre humanos e outros mamíferos e devem ser considerados quando se analisam opções terapêuticas para distúrbios motores, como a lesão medular (LM)....

Protocol

Todos os procedimentos de manuseamento, cirúrgicos e pós-operatórios foram aprovados pela Comissão Interna Molecular do Instituto de Medicina (ORBEA) e pela Comissão de Ética Animal (DGAV) de acordo com as diretrizes da Comunidade Europeia (Diretiva 2010/63/UE) e a lei portuguesa sobre cuidados com animais (DL 113/2013) sob a licença 0421/000/000/2022. Camundongos fêmeas C57Bl/6J com idade de 9 semanas foram utilizados para o presente estudo. Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais e d.......

Representative Results

O sistema padrão de SNF descreve os déficits motores grossos após LM14. Devido à sua natureza subjetiva, outros ensaios quantitativos são geralmente realizados ao lado do SNF para produzir uma avaliação mais detalhada e fina da locomoção. No entanto, esses testes falham em mostrar informações específicas sobre ciclos de passos, padrões de passos e coordenação membro torácico-membro pélvico, o que é extremamente importante para entender como o circuito espinhal mantém a função .......

Discussion

Aqui, o potencial do método de MouseWalker é demonstrado pela análise do comportamento locomotor após LM. Ele fornece novos insights sobre alterações específicas nos padrões de pisada, pegada e marcha que, de outra forma, seriam perdidas por outros testes padrão. Além de fornecer uma versão atualizada do pacote MW, as ferramentas de análise de dados também são descritas usando os scripts Python fornecidos (consulte a etapa 5).

Como o MW gera um grande conjunto de dados e uma cole.......

Acknowledgements

Os autores agradecem a Laura Tucker e Natasa Loncarevic pelos comentários sobre o manuscrito e pelo apoio dado pelo Serviço de Roedores do Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Os autores agradecem o apoio financeiro dos Prémios Santa Casa Neurociências - Prémio Melo e Castro para Investigação em Lesão Medular (MC-36/2020) a L.S. e C.S.M. Este trabalho foi apoiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 e UIDP/04462/2020), e LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) ao C.S.M. L.S. foi apoiado por um contrato de Investigador Principal Individual do CEEC (2021.02253.CEECIND). A A.F.I. foi apoiada por uma bo....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
45º Mirror 
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each sideMisumi
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each sideMisumi
1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm longMisumi
87 x 23 cm mirrorGeneral glass supplier 
black cardboard filler General stationery supplierWe used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror
Background backlight
109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick)General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each sideMisumi
multicolor LED stripGeneral hardware supplier
white opaque paper to cover the plexyglassGeneral stationery supplier
fTIR Support base and posts
2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm heightMisumi
60 x 30 cm metric breadboardEdmund Optics #54-641
M6 12 mm screwsEdmund Optics 
M6 hex nuts and wahersEdmund Optics 
fTIR Walkway 
109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick)General hardware supplier109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick)
109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass)General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each sideMisumi
black cardboard filler General stationery supplierwe used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges
12 mm screwsEdmund Optics M6
High speed camera (on a tripod)
Blackfly S USB3BlackflyUSB3This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second
Infinite Horizon Impactor 
Infinite Horizon Impactor Precision Systems and Instrumentation, LLC.
Lens
Nikkon AF Zoom-Nikkor 24-85mmNikkon 2.8-4D IFThis lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals
Software
MATLAB R2022bMathWorks
Python 3.9.13 Python Software Foundation
Anaconda Navigator 2.1.4Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5 Spyder Project Contributors
Walkway wall 
2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cmAny bricolage convenience store
2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm heightAny bricolage convenience store
GitHub Materials
Folder nameURL
Boxplotshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/BoxplotsScript to create Boxplots
Docshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/DocsAdditional documents
Heatmaphttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/HeatmapsScript to create heatmap
Matlat scripthttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20ScriptMouseWalker matlab script
PCAhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plotsScript to perform Principal Component Analysis
Raw data Plotshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20PlotsScript to create Raw data plots
Residual Analysishttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_AnalysisCode to compute residuals from Raw data

References

  1. Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
  2. Grillner, S. Biological pattern generation: The ce....

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