Uso do MouseWalker para Quantificar a Disfunção Locomotora em um Modelo de Lesão Medular em Camundongos

Summary

Um pipeline experimental para descrever quantitativamente o padrão locomotor de camundongos que caminham livremente usando a caixa de ferramentas MouseWalker (MW) é fornecido, variando de gravações de vídeo iniciais e rastreamento até análise pós-quantificação. Um modelo de lesão por contusão medular em camundongos é empregado para demonstrar a utilidade do sistema MW.

Abstract

A execução de programas motores complexos e de alta coordenação, como caminhada e corrida, é dependente da ativação rítmica dos circuitos espinhal e supra-espinhal. Após uma lesão medular torácica, a comunicação com os circuitos a montante é prejudicada. Isso, por sua vez, leva a uma perda de coordenação, com potencial de recuperação limitado. Assim, para melhor avaliar o grau de recuperação após a administração de fármacos ou terapias, há necessidade de novas ferramentas, mais detalhadas e precisas, para quantificar a marcha, a coordenação dos membros e outros aspectos finos do comportamento locomotor em modelos animais de lesão medular. Vários ensaios foram desenvolvidos ao longo dos anos para avaliar quantitativamente o comportamento de marcha livre em roedores; no entanto, eles geralmente carecem de medidas diretas relacionadas a estratégias de marcha escalonada, padrões de pegadas e coordenação. Para resolver essas deficiências, uma versão atualizada do MouseWalker, que combina uma passarela de reflexão interna total frustrada (fTIR) com software de rastreamento e quantificação, é fornecida. Este sistema de código aberto foi adaptado para extrair várias saídas gráficas e parâmetros cinemáticos, e um conjunto de ferramentas de pós-quantificação pode ser para analisar os dados de saída fornecidos. Este manuscrito também demonstra como esse método, aliado a testes comportamentais já estabelecidos, descreve quantitativamente déficits locomotores após lesão medular.

Introduction

A coordenação efetiva dos quatro membros não é exclusiva dos animais quadrúpedes. A coordenação membro torácico-membro pélvico em humanos continua sendo importante para a realização de diversas tarefas, como natação e alterações da velocidade durante a^marcha1. Vários programas^cinemáticos e motores^{dos membros2,3,4}, bem como circuitos de feedback proprioceptivo5, são conservados entre humanos e outros mamíferos e devem ser considerados quando se analisam opções terapêuticas para distúrbios motores, como a lesão medular (LM)^....

Protocol

Todos os procedimentos de manuseamento, cirúrgicos e pós-operatórios foram aprovados pela Comissão Interna Molecular do Instituto de Medicina (ORBEA) e pela Comissão de Ética Animal (DGAV) de acordo com as diretrizes da Comunidade Europeia (Diretiva 2010/63/UE) e a lei portuguesa sobre cuidados com animais (DL 113/2013) sob a licença 0421/000/000/2022. Camundongos fêmeas C57Bl/6J com idade de 9 semanas foram utilizados para o presente estudo. Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais e d.......

Discussion

Aqui, o potencial do método de MouseWalker é demonstrado pela análise do comportamento locomotor após LM. Ele fornece novos insights sobre alterações específicas nos padrões de pisada, pegada e marcha que, de outra forma, seriam perdidas por outros testes padrão. Além de fornecer uma versão atualizada do pacote MW, as ferramentas de análise de dados também são descritas usando os scripts Python fornecidos (consulte a etapa 5).

Como o MW gera um grande conjunto de dados e uma cole.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
45º Mirror
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side	Misumi
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side	Misumi
1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long	Misumi
87 x 23 cm mirror	General glass supplier
black cardboard filler	General stationery supplier		We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror
Background backlight
109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick)	General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side	Misumi
multicolor LED strip	General hardware supplier
white opaque paper to cover the plexyglass	General stationery supplier
fTIR Support base and posts
2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height	Misumi
60 x 30 cm metric breadboard	Edmund Optics	#54-641
M6 12 mm screws	Edmund Optics
M6 hex nuts and wahers	Edmund Optics
fTIR Walkway
109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick)	General hardware supplier		109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick)
109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass)	General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side	Misumi
black cardboard filler	General stationery supplier		we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges
12 mm screws	Edmund Optics	M6
High speed camera (on a tripod)
Blackfly S USB3	Blackfly	USB3	This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second
Infinite Horizon Impactor
Infinite Horizon Impactor	Precision Systems and Instrumentation, LLC.
Lens
Nikkon AF Zoom-Nikkor 24-85mm	Nikkon	2.8-4D IF	This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals
Software
MATLAB R2022b	MathWorks
Python 3.9.13	Python Software Foundation
Anaconda Navigator 2.1.4	Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5	Spyder Project Contributors
Walkway wall
2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm	Any bricolage convenience store
2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height	Any bricolage convenience store
GitHub Materials
Folder name	URL
Boxplots	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots		Script to create Boxplots
Docs	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs		Additional documents
Heatmap	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps		Script to create heatmap
Matlat script	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script		MouseWalker matlab script
PCA	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots		Script to perform Principal Component Analysis
Raw data Plots	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots		Script to create Raw data plots
Residual Analysis	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis		Code to compute residuals from Raw data