Scaffolds Decelularizados Derivados de Maçã para Engenharia de Tecido Ósseo In Vitro e In Vivo

Summary

Neste estudo, detalhamos métodos de decelularização, caracterização física, imageamento e implantação in vivo de biomateriais de base vegetal, bem como métodos de semeadura e diferenciação celular nos scaffolds. Os métodos descritos permitem a avaliação de biomateriais de origem vegetal para aplicações em engenharia de tecido ósseo.

Abstract

Biomateriais de celulose derivados de plantas têm sido empregados em diversas aplicações de engenharia de tecidos. Estudos in vivo têm demonstrado a notável biocompatibilidade de arcabouços feitos de celulose derivada de fontes naturais. Além disso, esses arcabouços possuem características estruturais relevantes para múltiplos tecidos e promovem a invasão e proliferação de células de mamíferos. Pesquisas recentes utilizando tecido hipântio de maçã decelularizado demonstraram a semelhança de seu tamanho de poro com o do osso trabecular, bem como sua capacidade de apoiar efetivamente a diferenciação osteogênica. O presente estudo examinou ainda o potencial de scaffolds de celulose derivados de maçã para aplicações em engenharia de tecido ósseo (BTE) e avaliou suas propriedades mecânicas in vitro e in vivo . Pré-osteoblastos MC3T3-E1 foram semeados em scaffolds de celulose derivados de maçã que foram então avaliados quanto ao seu potencial osteogênico e propriedades mecânicas. A coloração de fosfatase alcalina e S vermelho de alizarina confirmou a diferenciação osteogênica em scaffolds cultivados em meio de diferenciação. O exame histológico demonstrou invasão celular generalizada e mineralização através dos scaffolds. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) revelou agregados minerais na superfície dos scaffolds, e a espectroscopia de energia dispersiva (EDS) confirmou a presença de elementos fosfato e cálcio. No entanto, apesar de um aumento significativo no módulo de Young após a diferenciação celular, ele permaneceu menor do que o do tecido ósseo normal. Estudos in vivo mostraram infiltração celular e deposição de matriz extracelular dentro dos arcabouços derivados de maçãs decelularizadas após 8 semanas de implantação na calvária de ratos. Além disso, a força necessária para remover os scaffolds do defeito ósseo foi semelhante à carga de fratura relatada anteriormente do osso nativo da calota. No geral, este estudo confirma que a celulose derivada da maçã é uma candidata promissora para aplicações em BTE. Entretanto, a dissimilaridade entre suas propriedades mecânicas e as do tecido ósseo normal pode restringir sua aplicação a cenários de baixa carga de carga. Reengenharia estrutural adicional e otimização podem ser necessárias para melhorar as propriedades mecânicas de andaimes de celulose derivados de maçã para aplicações de suporte de carga.

Introduction

Grandes defeitos ósseos causados por uma lesão ou doença frequentemente requerem enxertos de biomateriais para regeneração completa¹. As técnicas atuais destinadas a melhorar a regeneração do tecido ósseo utilizam regularmente enxertos autólogos, alogênicos, xenogênicos ou sintéticos². Para o enxerto ósseo autólogo, considerado a prática de enxerto "padrão ouro" para reparar grandes defeitos ósseos, o osso é extraído do paciente. No entanto, esse procedimento de enxertia tem várias desvantagens, incluindo limitações de tamanho e forma, disponibilidade de tecido e morbidade do local de amostragem³.....

Protocol

Os protocolos experimentais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Ottawa.

1. Preparação do andaime

1. Use uma fatia de bandolim para cortar maçãs McIntosh (Canada Fancy) em fatias de 8 mm de espessura. Corte o tecido do hipântio das fatias de maçã em quadrados de 5 mm x 5 mm.
2. Colocar as amostras quadradas em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,1% durante 2 dias.
3. Lavar as amostras decelularizadas co.......

Discussion

Vários estudos in vitro e in vivo têm demonstrado a biocompatibilidade da celulose vegetal e seu potencial uso na engenharia tecidual 14,15,16,18,19,20, mais especificamente para hospedar a diferenciação osteogênica ^20,21. Os objetivos do prese.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology