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Neste estudo, detalhamos métodos de decelularização, caracterização física, imageamento e implantação in vivo de biomateriais de base vegetal, bem como métodos de semeadura e diferenciação celular nos scaffolds. Os métodos descritos permitem a avaliação de biomateriais de origem vegetal para aplicações em engenharia de tecido ósseo.
Biomateriais de celulose derivados de plantas têm sido empregados em diversas aplicações de engenharia de tecidos. Estudos in vivo têm demonstrado a notável biocompatibilidade de arcabouços feitos de celulose derivada de fontes naturais. Além disso, esses arcabouços possuem características estruturais relevantes para múltiplos tecidos e promovem a invasão e proliferação de células de mamíferos. Pesquisas recentes utilizando tecido hipântio de maçã decelularizado demonstraram a semelhança de seu tamanho de poro com o do osso trabecular, bem como sua capacidade de apoiar efetivamente a diferenciação osteogênica. O presente estudo examinou ainda o potencial de scaffolds de celulose derivados de maçã para aplicações em engenharia de tecido ósseo (BTE) e avaliou suas propriedades mecânicas in vitro e in vivo . Pré-osteoblastos MC3T3-E1 foram semeados em scaffolds de celulose derivados de maçã que foram então avaliados quanto ao seu potencial osteogênico e propriedades mecânicas. A coloração de fosfatase alcalina e S vermelho de alizarina confirmou a diferenciação osteogênica em scaffolds cultivados em meio de diferenciação. O exame histológico demonstrou invasão celular generalizada e mineralização através dos scaffolds. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) revelou agregados minerais na superfície dos scaffolds, e a espectroscopia de energia dispersiva (EDS) confirmou a presença de elementos fosfato e cálcio. No entanto, apesar de um aumento significativo no módulo de Young após a diferenciação celular, ele permaneceu menor do que o do tecido ósseo normal. Estudos in vivo mostraram infiltração celular e deposição de matriz extracelular dentro dos arcabouços derivados de maçãs decelularizadas após 8 semanas de implantação na calvária de ratos. Além disso, a força necessária para remover os scaffolds do defeito ósseo foi semelhante à carga de fratura relatada anteriormente do osso nativo da calota. No geral, este estudo confirma que a celulose derivada da maçã é uma candidata promissora para aplicações em BTE. Entretanto, a dissimilaridade entre suas propriedades mecânicas e as do tecido ósseo normal pode restringir sua aplicação a cenários de baixa carga de carga. Reengenharia estrutural adicional e otimização podem ser necessárias para melhorar as propriedades mecânicas de andaimes de celulose derivados de maçã para aplicações de suporte de carga.
Grandes defeitos ósseos causados por uma lesão ou doença frequentemente requerem enxertos de biomateriais para regeneração completa1. As técnicas atuais destinadas a melhorar a regeneração do tecido ósseo utilizam regularmente enxertos autólogos, alogênicos, xenogênicos ou sintéticos2. Para o enxerto ósseo autólogo, considerado a prática de enxerto "padrão ouro" para reparar grandes defeitos ósseos, o osso é extraído do paciente. No entanto, esse procedimento de enxertia tem várias desvantagens, incluindo limitações de tamanho e forma, disponibilidade de tecido e morbidade do local de amostragem3.....
Os protocolos experimentais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Ottawa.
1. Preparação do andaime
Medida do tamanho dos poros, distribuição celular e mineralização in vitro (Figura 1 e Figura 2)
A remoção completa dos componentes celulares nativos dos scaffolds de tecido macieira foi obtida após o tratamento dos scaffolds com SDS e CaCl2 (Figura 1A). Os scaffolds exibiam uma estrutura altamente porosa, o que foi confirmado por microscopia confocal. A quantificação das imagens demo.......
Vários estudos in vitro e in vivo têm demonstrado a biocompatibilidade da celulose vegetal e seu potencial uso na engenharia tecidual 14,15,16,18,19,20, mais especificamente para hospedar a diferenciação osteogênica 20,21. Os objetivos do prese.......
O financiamento para este projeto foi fornecido pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) (Discovery Grant) e pela Fundação Li Ka Shing. M.L.L. recebeu apoio do programa Ontario Centers of Excellence TalentEdge, e R.J.H. foi apoiado por uma bolsa de pós-graduação NSERC e uma Ontario Graduate Scholarship (OGS).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
4′,6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher | D1306 | DAPI |
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium | Sigma-Aldrich | B5655 | BCIP/NBT |
Alizarin red S | Sigma-Aldrich | A5533 | ARS |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Cell Culture |
Calcium Chloride | ThermoFisher | AA12316 | CaCl2 |
Calcofluor White | Sigma-Aldrich | 18909 | |
Dental drill | Surgical tool | ||
Ethanol | ThermoFisher | 615095000 | |
Fetal bovine serum | Hyclone Laboratories | SH30396 | FBS |
Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | 10% Formalin |
Goldner's trichrome stain | Sigma-Aldrich | 1.00485 | GTC |
Hematoxylin and eosin stain | Fisher Scientific | NC1470670 | H&E |
High-speed resonant confocal laser scanning microscope | Nikon | Nikon Ti-E A1-R | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
ImageJ software | National Institutes of Health | ||
Irrigation saline | Baxter | JF7123 | 0.9% NaCl |
MC3T3-E1 Subclone 4 cells | ATCC | CRL-2593 | Pre-osteoblast cells |
McIntosh apples | Canada Fancy grade | ||
Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909 | Histological embedding |
Minimum Essential Medium | ThermoFisher | M0894 | α-MEM |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 4%; PFA |
Penicillin/Streptomycin | Hyclone Laboratories | SV30010 | Cell Culture |
Periodic acid | Sigma-Aldrich | 375810 | |
Phosphate buffered saline | Hyclone Laboratories | 2810305 | PBS; without Ca2+ and Mg2+ |
Propidium iodide | Invitrogen | p3566 | |
Scanning electron microscope | JEOL | JSM-7500F FESEM | SEM and EDS |
Slide scanner microscope | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166 | SDS |
Sodium metabisulphite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
Sodium phosphate | ThermoFisher | BP329 | |
Sprague-Dawley rats | Charles-River Laboratories | 400 | Male |
Sutures | Ethicon | J494G | 4-0 |
Trephine | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | 5-mm diameter |
Triton-X 100 | ThermoFisher | 807423 | |
Trypsin | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | Cell Culture |
Tween | Fisher Scientific | BP337 | |
Universal compression Device | CellScale | UniVert | |
Von Kossa stain | Sigma-Aldrich | 1.00362 | Histology |
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