A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
В этом исследовании мы подробно описываем методы децеллюляризации, физической характеристики, визуализации и имплантации in vivo биоматериалов растительного происхождения, а также методы посева и дифференцировки клеток в скаффолдах. Описанные методы позволяют оценить биоматериалы растительного происхождения для применения в инженерии костной ткани.
Биоматериалы из целлюлозы растительного происхождения используются в различных приложениях тканевой инженерии. Исследования in vivo показали замечательную биосовместимость каркасов из целлюлозы, полученной из природных источников. Кроме того, эти каркасы обладают структурными характеристиками, которые имеют отношение к нескольким тканям, и они способствуют инвазии и пролиферации клеток млекопитающих. Недавние исследования с использованием децеллюляризованной ткани яблочного гипантия продемонстрировали сходство размера пор с размером пор трабекулярной кости, а также его способность эффективно поддерживать остеогенную дифференцировку. В настоящем исследовании также был изучен потенциал целлюлозных каркасов, полученных из яблок, для применения в инженерии костной ткани (BTE) и оценены их механические свойства in vitro и in vivo . Преостеобласты MC3T3-E1 были высеяны в целлюлозные каркасы, полученные из яблок, которые затем были оценены на предмет их остеогенного потенциала и механических свойств. Окрашивание щелочной фосфатазой и ализариновым красным S подтвердило остеогенную дифференцировку в скаффолдах, культивируемых в дифференцировочной среде. Гистологическое исследование показало обширную клеточную инвазию и минерализацию скаффолдов. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) выявила минеральные агрегаты на поверхности скаффолдов, а энергодисперсионная спектроскопия (ЭДС) подтвердила наличие фосфатных и кальциевых элементов. Однако, несмотря на значительное увеличение модуля Юнга после дифференцировки клеток, он оставался ниже, чем у здоровой костной ткани. Исследования in vivo показали клеточную инфильтрацию и отложение внеклеточного матрикса в децеллюляризованных каркасах, полученных из яблок, после 8 недель имплантации в кальварию крыс. Кроме того, сила, необходимая для удаления каркасов из костного дефекта, была аналогична ранее зарегистрированной нагрузке при переломе нативной пяточной кости. В целом, это исследование подтверждает, что целлюлоза, полученная из яблок, является многообещающим кандидатом для применения в заушных аппаратах. Тем не менее, несходство между его механическими свойствами и свойствами здоровой костной ткани может ограничить его применение сценариями с низкой нагрузкой. Для улучшения механических свойств целлюлозных лесов, полученных из яблок, может потребоваться дополнительная структурная реконструкция и оптимизация.
Большие костные дефекты, вызванные травмой или заболеванием, часто требуют трансплантатов биоматериала для полной регенерации1. Современные методы, предназначенные для улучшения регенерации костной ткани, регулярно используют аутологичные, аллогенные, ксеногенные или синтетические трансплантаты2. Для аутологичной костной пластики, которая считается «золотым стандартом» трансплантации для исправления больших костных дефектов, кость извлекается у пациента. Тем не менее, эта процедура трансплантации имеет ряд недостатков, включая ограничения по размеру и форме, доступность тканей и заболеваемость в месте забора материала
Протоколы экспериментов были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Оттавы.
1. Подготовка строительных лесов
Измерение размера пор, распределение клеток и минерализация in vitro (Рисунок 1 и Рисунок 2)
Полное удаление нативных клеточных компонентов каркасов тканей яблони было достигнуто после обработки скаффолдов SDS и CaCl2 (рис. 1А
Несколько исследований in vitro и in vivo продемонстрировали биосовместимость целлюлозы растительного происхождения и ее потенциальное использование в тканевой инженерии 14,15,16,18,19,20, в частности, для проведения остеогенной дифференциации <.......
Заявление о конфликте интересов: M.L.L., M.T. R.J.H., C.M.C., I.C. и A.P. являются изобретателями по патентным заявкам, поданным Университетом Оттавы и компанией Spiderwort Inc. в отношении использования целлюлозы растительного происхождения для заушных применений. M.L.L., R.J.H., C.M.C. и A.P. имеют финансовые интересы в Spiderwort Inc.
Финансирование этого проекта было предоставлено Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) (грант на открытие) и Фондом Ли Ка Шина. M.L.L. получил поддержку от программы Ontario Centers of Excellence TalentEdge, а R.J.H. получил стипендию для аспирантов NSERC и стипендию для выпускников Онтарио (OGS).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
4′,6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher | D1306 | DAPI |
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium | Sigma-Aldrich | B5655 | BCIP/NBT |
Alizarin red S | Sigma-Aldrich | A5533 | ARS |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Cell Culture |
Calcium Chloride | ThermoFisher | AA12316 | CaCl2 |
Calcofluor White | Sigma-Aldrich | 18909 | |
Dental drill | Surgical tool | ||
Ethanol | ThermoFisher | 615095000 | |
Fetal bovine serum | Hyclone Laboratories | SH30396 | FBS |
Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | 10% Formalin |
Goldner's trichrome stain | Sigma-Aldrich | 1.00485 | GTC |
Hematoxylin and eosin stain | Fisher Scientific | NC1470670 | H&E |
High-speed resonant confocal laser scanning microscope | Nikon | Nikon Ti-E A1-R | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
ImageJ software | National Institutes of Health | ||
Irrigation saline | Baxter | JF7123 | 0.9% NaCl |
MC3T3-E1 Subclone 4 cells | ATCC | CRL-2593 | Pre-osteoblast cells |
McIntosh apples | Canada Fancy grade | ||
Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909 | Histological embedding |
Minimum Essential Medium | ThermoFisher | M0894 | α-MEM |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 4%; PFA |
Penicillin/Streptomycin | Hyclone Laboratories | SV30010 | Cell Culture |
Periodic acid | Sigma-Aldrich | 375810 | |
Phosphate buffered saline | Hyclone Laboratories | 2810305 | PBS; without Ca2+ and Mg2+ |
Propidium iodide | Invitrogen | p3566 | |
Scanning electron microscope | JEOL | JSM-7500F FESEM | SEM and EDS |
Slide scanner microscope | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166 | SDS |
Sodium metabisulphite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
Sodium phosphate | ThermoFisher | BP329 | |
Sprague-Dawley rats | Charles-River Laboratories | 400 | Male |
Sutures | Ethicon | J494G | 4-0 |
Trephine | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | 5-mm diameter |
Triton-X 100 | ThermoFisher | 807423 | |
Trypsin | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | Cell Culture |
Tween | Fisher Scientific | BP337 | |
Universal compression Device | CellScale | UniVert | |
Von Kossa stain | Sigma-Aldrich | 1.00362 | Histology |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved