Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Neuroscience
יישור של טומוגרפיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של אור נראה עם תמונות קונפוקליות של אותה רשתית עכבר
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים ליישור תמונות טומוגרפיה של טומוגרפיה קוהרנטית אופטית באור נראה (vis-OCTF) עם תמונות קונפוקליות ex vivo של אותה רשתית עכבר לצורך אימות המורפולוגיה של צרור האקסון של תאי גנגליון הרשתית שנצפו בתמונות in vivo .
בשנים האחרונות, הדמיית רשתית in vivo , המספקת מידע לא פולשני, בזמן אמת ואורך על מערכות ותהליכים ביולוגיים, מיושמת יותר ויותר כדי לקבל הערכה אובייקטיבית של נזק עצבי במחלות עיניים. הדמיה קונפוקלית Ex vivo של אותה רשתית נחוצה לעתים קרובות כדי לאמת את ממצאי in vivo במיוחד במחקר בבעלי חיים. במחקר זה הדגמנו שיטה ליישור תמונה קונפוקלית ex vivo של רשתית העכבר עם תמונות in vivo שלה. טכנולוגיית הדמיה קלינית חדשה הנקראת סיבוגרפיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של אור נראה (vis-OCTF) יושמה כדי לרכוש תמונות in vivo של רשתית העכבר. לאחר מכן ביצענו הדמיה קונפוקלית של אותה רשתית כמו "תקן הזהב" כדי לאמת את תמונות in vivo מול OCTF. מחקר זה לא רק מאפשר חקירה נוספת של המנגנונים המולקולריים והתאיים, אלא גם מבסס בסיס להערכה רגישה ואובייקטיבית של נזק עצבי in vivo.
תאי גנגליון ברשתית (RGCs) ממלאים תפקיד קריטי בעיבוד מידע חזותי, מקבלים קלט סינפטי דרך העצים הדנדריטיים שלהם בשכבת הפרספקס הפנימית (IPL) ומעבירים את המידע דרך האקסונים שלהם בשכבת סיבי עצב הרשתית (RNFL) למוח 1,2,3,4. במצבים חולים כגון גלאוקומה, ניוון RGC מוקדם עלול לגרום לשינויים עדינים ב- RNFL, בשכבת תאי הגנגליון (GCL), ב- IPL ובעצב הראייה הן בחולים והן בדגמי מכרסמים 5,6,7,8,9.
כל הנהלים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת וירג'יניה ותאמו את ההנחיה לשימוש בבעלי חיים מהמכון הלאומי לבריאות (NIH). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הדמי?.......
הסיבגרם המרוכב vis-OCT מושווה לתמונה קונפוקלית מקבילה של רשתית שטוחה עם Tuj-1 עבור אקסוני RGC (איור 1D, פאנל עליון). ניתן להתאים צרורות אקסונים שצולמו על ידי vis-OCTF עם חבילות האקסון המסומנות ב- Tu-j1 בתמונה הקונפוקלית. כלי דם בדרך כלל מציגים מבנים מסתעפים מובחנים בהשוואה לצרורות האקסון .......
ישנם שני שלבים בפרוטוקול זה הדורשים תשומת לב. ראשית, יש לוודא כי בעל החיים נמצא תחת הרדמה עמוקה וכי העיניים שלהם מורחבות לחלוטין לפני הדמיה vis-OCT. אם העכברים אינם מורדמים כראוי, נשימתם המהירה עלולה להוביל לתנועות לא יציבות של תמונות הפנים , מה שעלול להשפיע לרעה על איכות הסיבגרם. יתר על כ?.......
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
| Drugs and antibodies | |||
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
| Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
| Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) | Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
| Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (Reagent Grade) | VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
- Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
- Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
- Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
- Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
- Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).
- Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
- Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
- Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
- Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
- Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).
- Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
- Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
- Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
- Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
- Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
- Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
- Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
- Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
- Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved