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Neuroscience

Align of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina(가시광선 광간섭 단층 촬영 파이버그램과 동일한 마우스 망막의 컨포칼 이미지 정렬)

Published: June 30th, 2023

DOI:

10.3791/65237

1Department of Biology, University of Virginia, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Department of Ophthalmology, University of Virginia, 4Program in Fundamental Neuroscience, University of Virginia, 5Department of Psychology, University of Virginia

본 프로토콜은 in vivo 이미지에서 관찰된 망막 신경절 세포 축삭 다발 형태를 검증하기 위한 목적으로 in vivo 가시광선 광간섭 단층 촬영 fibergraphy(vis-OCTF) 이미지를 동일한 마우스 망막의 ex vivo 공초점 이미지와 정렬하는 단계를 설명합니다.

최근 몇 년 동안 생체 시스템 및 프로세스에 대한 비침습적, 실시간 및 종단 정보를 제공하는 생체 내 망막 영상이 안과 질환의 신경 손상에 대한 객관적인 평가를 얻기 위해 점점 더 많이 적용되고 있습니다. 동일한 망막의 생체 외 공초점 이미징은 특히 동물 연구에서 생체 내 결과를 검증하는 데 필요한 경우가 많습니다. 이 연구에서는 생쥐 망막의 생체 외 공초점 이미지를 생체 내 이미지와 정렬하는 방법을 시연했습니다. 가시광선 광간섭 단층 촬영 섬유촬영(vis-OCTF)이라는 새로운 임상 준비 이미징 기술을 적용하여 생쥐 망막의 생체 내 이미지를 획득했습니다. 그런 다음 "골드 스탠다드"와 동일한 망막의 컨포칼 이미징을 수행하여 in vivo vis-OCTF 이미지를 검증했습니다. 이 연구는 분자 및 세포 메커니즘에 대한 추가 연구를 가능하게 할 뿐만 아니라 생체 내 신경 손상에 대한 민감하고 객관적인 평가를 위한 기반을 마련합니다.

망막 신경절 세포(RGC)는 시각 정보 처리에 중요한 역할을 하며, 내부 망상층(IPL)의 수지상 나무를 통해 시냅스 입력을 받고 망막 신경 섬유층(RNFL)의 축삭을 통해 뇌로 정보를 전달합니다 1,2,3,4. 녹내장과 같은 질병이 있는 상태에서, 초기 망막 신경절 변성은 환자와 설치류 모델 모두에서 RNFL, 신경절 세포층(GCL), IPL 및 시신경에 미묘한 변화를 초래할 수 있다 5,6,7,8,9. 따라서 망막 신경절 세포의 이러한 형태학적 변화를 조기에 발견하는 것은 망막 신경절 세포와 시력 상실을 예방하기 위한 적시 개입에 필수적입니다.

당사는 최근 망막 신경절 손상의 생....

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모든 동물 시술은 버지니아 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 미국 국립보건원(NIH)의 동물 사용 지침을 준수했습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 기기와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. In vivo vis-OCT 이미징

  1. vis-OCT 시스템
    1. 480nm에서 650nm 사이의 가시광선 조명을 제공하는 ?.......

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복합 vis-OCT 파이버그램은 망막 신경절 축삭돌기에 대해 Tuj-1로 면역염색된 평판 장착 망막의 해당 컨포칼 이미지와 비교됩니다(그림 1D, 상단 패널). vis-OCTF로 이미징된 축삭 다발은 공초점 이미지에서 Tu-j1 표지된 축삭 다발과 일치시킬 수 있습니다. 혈관은 일반적으로 섬유그램 이미지에서 주변 축삭 다발과 비교하여 구별 가능한 분지 구조를 나타내며, 이는 공초점 이미지?.......

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이 프로토콜에는 주의가 필요한 두 단계가 있습니다. 첫째, 동물이 깊은 마취 상태인지 확인하고 vis-OCT 영상 전에 눈이 완전히 확장되었는지 확인해야 합니다. 마우스가 적절하게 마취되지 않으면 빠른 호흡으로 인해 얼굴 이미지의 불안정한 움직임이 발생할 수 있으며, 이는 파이버그램의 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 불충분한 팽창은 홍채가 빛을 차단하여 망막에 도?.......

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이 연구는 녹내장 연구 재단 Shaffer Grant, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 및 Knights Templar Eye Foundation의 지원을 받습니다.

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Halo 100Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscopeCarl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)Santz Cruz Biotechnology, SC-2816921-2 drops
Bovine serum albumin powderFisher Scientific, BP9706-1001:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dyeThermo Fisher Scientific, Cat# A-212021:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dyeThermo Fisher Scientific, Cat# A-212091:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))Covetrus, NDC 11695-4860-115.6 mg/mL
KetamineCovetrus, NADA043304114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia1:200
Normal donkey serum(NDS)Millipore Sigma, S30-100 mL1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4
(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)		Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K31:10
Rat anti-ICAM-2BD Pharmingen, Cat#5533251:500
Tropicamide drops Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100
(Reagent Grade)		VWR, CAS: 9002-93-11:20
Vectashield mounting mediumVector Laboratories Inc. H2000-10
XylazineCovetrus, NDC59399-110-2017 mg/kg

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