Justering av optisk koherenstomografi i synligt ljus med konfokala bilder av samma musnäthinna

I detta protokoll beskrivs stegen för att anpassa in vivo-bilder med optisk koherenstomografifibergrafi (vis-OCTF) i synligt ljus med ex vivo konfokala bilder av samma musnäthinna i syfte att verifiera den observerade morfologin för näthinnans gangliecellsaxonbunt i in vivo-bilderna.

Under de senaste åren har in vivo retinal avbildning, som ger icke-invasiv, realtids- och longitudinell information om biologiska system och processer, i allt högre grad tillämpats för att få en objektiv bedömning av nervskador vid ögonsjukdomar. Ex vivo konfokal avbildning av samma näthinna är ofta nödvändig för att validera in vivo-fynden, särskilt i djurförsök. I denna studie demonstrerade vi en metod för att anpassa en ex vivo konfokalbild av musens näthinna med dess in vivo-bilder. En ny klinisk avbildningsteknik som kallas synligt ljus optisk koherenstomografi fibergrafi (vis-OCTF) användes för att ta in vivo-bilder av musens näthinna. Vi utförde sedan den konfokala avbildningen av samma näthinna som "guldstandarden" för att validera in vivo vis-OCTF-bilderna. Denna studie möjliggör inte bara ytterligare undersökning av de molekylära och cellulära mekanismerna utan etablerar också en grund för en känslig och objektiv utvärdering av nervskador in vivo.

Retinala ganglieceller (RGC) spelar en avgörande roll i visuell informationsbearbetning, tar emot synaptiska intryck genom sina dendritiska träd i det inre plexiforma skiktet (IPL) och överför informationen via sina axoner i retinala nervfiberskiktet (RNFL) till hjärnan 1,2,3,4. Vid sjukdomstillstånd som glaukom kan tidig RGC-degeneration resultera i subtila förändringar i RNFL, gangliecelskiktet (GCL), IPL och synnerven hos både patienter och gnagarmodeller 5,6,7,8,9.

Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Virginia och överensstämde med riktlinjerna för användning av djur från National Institute of Health (NIH). Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material, reagenser och instrument som används i detta protokoll.

1. In vivo i förhållande till OCT-avbildning

1. Vis-ULT-systemet
   1. Föreställ dig mössens ögon med hjälp av .......

Det sammansatta vis-OCT-fibergrammet jämförs med motsvarande konfokalbild av platt monterad näthinna immunfärgad med Tuj-1 för RGC-axoner (figur 1D, övre panelen). Axonbuntar avbildade av vis-OCTF kan matchas med de Tu-j1-märkta axonbuntarna på konfokalbilden. Blodkärl uppvisar vanligtvis urskiljbara förgreningsstrukturer jämfört med omgivande axonbuntar i fibergrambilder, vilket kan matchas med de ICAM-2-märkta blodkärlen på konfokalbilden (Figur 1D

Det finns två steg i det här protokollet som kräver uppmärksamhet. För det första är det nödvändigt att se till att djuret är under djup bedövning och att ögonen är helt vidgade före ULT-avbildning. Om mössen inte är tillräckligt bedövade kan deras snabba andning leda till instabila rörelser i ansiktsbilderna , vilket kan påverka fibergrammets kvalitet negativt. Dessutom kan otillräcklig utvidgning också ha en negativ inverkan på bildkvaliteten eftersom iris kan hindra ljuset och hindra de.......

Denna studie stöds av Glaucoma Research Foundation Shaffer Grant, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 och Knights Templar Eye Foundation.