JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Neuroscience

Görünür Işık Optik Koherens Tomografi Fibergramlarının Aynı Fare Retinasının Konfokal Görüntüleri ile Hizalanması

Published: June 30th, 2023

DOI:

10.3791/65237

1Department of Biology, University of Virginia, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Department of Ophthalmology, University of Virginia, 4Program in Fundamental Neuroscience, University of Virginia, 5Department of Psychology, University of Virginia

Mevcut protokol, in vivo görüntülerde gözlenen retinal ganglion hücre akson demeti morfolojisini doğrulamak amacıyla in vivo görünür ışık optik koherens tomografi fibergrafi (vis-OCTF) görüntülerini aynı fare retinasının ex vivo konfokal görüntüleriyle hizalama adımlarını özetlemektedir.

Son yıllarda, biyolojik sistemler ve süreçler hakkında non-invaziv, gerçek zamanlı ve boylamsal bilgi sağlayan in vivo retinal görüntüleme, göz hastalıklarında nöral hasarın objektif bir değerlendirmesini elde etmek için giderek daha fazla uygulanmaktadır. Aynı retinanın ex vivo konfokal görüntülemesi, özellikle hayvan araştırmalarında in vivo bulguları doğrulamak için sıklıkla gereklidir. Bu çalışmada, fare retinasının ex vivo konfokal görüntüsünü in vivo görüntüleriyle hizalamak için bir yöntem gösterdik. Fare retinasının in vivo görüntülerini elde etmek için görünür ışık optik koherens tomografi fibergrafisi (vis-OCTF) adı verilen yeni bir klinik kullanıma hazır görüntüleme teknolojisi uygulandı. Daha sonra in vivo ve OCTF görüntülerini doğrulamak için "altın standart" ile aynı retinanın konfokal görüntülemesini gerçekleştirdik. Bu çalışma sadece moleküler ve hücresel mekanizmaların daha fazla araştırılmasını sağlamakla kalmaz, aynı zamanda in vivo nöral hasarın hassas ve objektif bir değerlendirmesi için bir temel oluşturur.

Retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) görsel bilgi işlemede kritik bir rol oynar, iç pleksiform tabakadaki (IPL) dendritik ağaçları aracılığıyla sinaptik girdiler alır ve bilgiyi retina sinir lifi tabakasındaki (RNFL) aksonları aracılığıyla beyne iletir 1,2,3,4. Glokom gibi hastalıklı durumlarda, erken RGC dejenerasyonu, hem hastalarda hem de kemirgen modellerindeRNFL, ganglion hücre tabakası (GCL), IPL ve optik sinirde ince değişikliklere neden olabilir 5,6....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm hayvan prosedürleri, Virginia Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün (NIH) Hayvanların Kullanımı kılavuzuna uygun hale getirildi. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. İn vivo vis-OCT görüntüleme

  1. Vis-OCT sistemi
    1. 480 nm ile 650 nm arasında görünür .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kompozit vis-OCT fibergramı, RGC aksonları için Tuj-1 ile immün boyanmış düz monte retinanın karşılık gelen konfokal görüntüsü ile karşılaştırılır (Şekil 1D, üst panel). Vis-OCTF ile görüntülenen akson demetleri, konfokal görüntüde Tu-j1 etiketli akson demetleri ile eşleştirilebilir. Kan damarları genellikle, konfokal görüntüdeki ICAM-2 etiketli kan damarları ile eşleştirilebilen fibergram görüntülerinde çevredeki akson demetlerine kıyasla ayırt ed.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokolde dikkat edilmesi gereken iki adım vardır. İlk olarak, hayvanın derin anestezi altında olduğundan ve OCT görüntülemeden önce gözlerinin tamamen genişlediğinden emin olmak gerekir. Fareler yeterince uyuşturulmazsa, hızlı nefes almaları, fibergramın kalitesini olumsuz yönde etkileyebilecek en yüz görüntülerinin dengesiz hareketlerine yol açabilir. Ayrıca, yetersiz genişleme de görüntü kalitesi üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir, çünkü iris ışığı engelleyere.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu çalışma Glokom Araştırma Vakfı Shaffer Grant, 4-CA Cavalier İşbirliği Ödülü, R01EY029121, R01EY035088 ve Tapınak Şövalyeleri Göz Vakfı tarafından desteklenmektedir.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Halo 100Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscopeCarl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)Santz Cruz Biotechnology, SC-2816921-2 drops
Bovine serum albumin powderFisher Scientific, BP9706-1001:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dyeThermo Fisher Scientific, Cat# A-212021:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dyeThermo Fisher Scientific, Cat# A-212091:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))Covetrus, NDC 11695-4860-115.6 mg/mL
KetamineCovetrus, NADA043304114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia1:200
Normal donkey serum(NDS)Millipore Sigma, S30-100 mL1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4
(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)		Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K31:10
Rat anti-ICAM-2BD Pharmingen, Cat#5533251:500
Tropicamide drops Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100
(Reagent Grade)		VWR, CAS: 9002-93-11:20
Vectashield mounting mediumVector Laboratories Inc. H2000-10
XylazineCovetrus, NDC59399-110-2017 mg/kg

  1. Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
  2. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  3. Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
  4. Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
  5. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
  6. Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
  7. Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).
  8. Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
  9. Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
  10. Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
  11. Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
  12. Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).
  13. Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
  14. Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
  15. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
  16. Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
  17. Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
  18. Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
  19. Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
  20. Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
  21. Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved