Direkte syntese av EM-synlige gullnanopartikler i celler for proteinlokaliseringsanalyse med godt bevart ultrastruktur

Analyse av nøyaktig lokalisering av proteinmolekyler i celler med ultrastrukturell oppløsning er av stor betydning for studiet av ulike fysiologiske eller patologiske prosesser i alle levende organismer. Derfor er utviklingen av klonbare koder som kan brukes som elektronmikroskopiprober av stor verdi, akkurat som fluorescerende proteiner har spilt en avgjørende rolle innen optisk bildebehandling. Autonukleasjonsundertrykkelsesmekanismen (ANSM) ble nylig avdekket, noe som muliggjør den spesifikke syntesen av gullnanopartikler (AuNP) på cysteinrike koder, som metallothionein (MT) og frostvæskeprotein (AFP).

Basert på ANSM ble det utviklet en elektronmikroskopisk merkingsteknologi som muliggjør spesifikk deteksjon av merkede proteiner i prokaryote og eukaryote celler med en enestående merkingseffektivitet. Denne studien illustrerer en protokoll for påvisning av MTn (en konstruert MT-variant som mangler aldehydreaktive rester) fusjonsproteiner i pattedyrceller med godt bevart ultrastruktur. I denne protokollen ble høytrykksfrysing og frysesubstitusjonsfiksering utført ved bruk av ikke-aldehydfikseringsmidler (som garvesyre, uranylacetat) for å bevare nær-naturlig ultrastruktur og unngå skade på merkeaktiviteten forårsaket av aldehyd-tverrbinding.

En enkel ett-trinns rehydrering ble brukt før den ANSM-baserte AuNP-syntesen. Resultatene viste at de merkede proteinene målrettet mot forskjellige organeller, inkludert membranene og lumen i endoplasmatisk retikulum (ER), og mitokondrielle matriser ble detektert med høy effektivitet og spesifisitet. Denne forskningen gir biologer en robust protokoll for å løse et enormt spekter av biologiske spørsmål på enkeltmolekylnivå i cellulære ultrastrukturelle sammenhenger.