Síntese Direta de Nanopartículas de Ouro EM-Visíveis em Células para Análise de Localização de Proteínas com Ultraestrutura Bem Preservada

Analisar a localização precisa de moléculas de proteínas em células com resolução ultraestrutural é de grande importância para o estudo de vários processos fisiológicos ou patológicos em todos os organismos vivos. Portanto, o desenvolvimento de tags clonáveis que podem ser usados como sondas de microscopia eletrônica é de grande valor, assim como proteínas fluorescentes têm desempenhado um papel crucial no campo da imagem óptica. O mecanismo de supressão da autonucleação (ANSM) foi recentemente descoberto, o que permite a síntese específica de nanopartículas de ouro (AuNPs) em etiquetas ricas em cisteína, como metalotioneína (MT) e proteína anticongelante (AFP).

Com base no ANSM, foi desenvolvida uma tecnologia de marcação por microscopia eletrônica que permite a detecção específica de proteínas marcadas em células procarióticas e eucarióticas com uma eficiência de marcação sem precedentes. Este estudo ilustra um protocolo para a detecção de proteínas de fusão de MTn (uma variante modificada de MT sem resíduos reativos a aldeídos) em células de mamíferos com ultraestrutura bem preservada. Neste protocolo, o congelamento a alta pressão e a fixação por substituição do congelamento foram realizados com fixadores não aldeídos (como ácido tânico, acetato de uranila) para preservar a ultraestrutura quase nativa e evitar danos à atividade do tag causados pela reticulação de aldeídos.

Uma reidratação simples em um passo foi usada antes da síntese de AuNP baseada em ANSM. Os resultados mostraram que as proteínas marcadas tiveram como alvo várias organelas, incluindo as membranas e o lúmen do retículo endoplasmático (RE), e matrizes mitocondriais foram detectadas com alta eficiência e especificidade. Esta pesquisa fornece aos biólogos um protocolo robusto para abordar uma enorme gama de questões biológicas no nível de molécula única em contextos ultraestruturais celulares.