Прямой синтез ЭМ-видимых наночастиц золота в клетках для анализа локализации белка с хорошо сохранившейся ультраструктурой

Анализ точной локализации белковых молекул в клетках с ультраструктурным разрешением имеет большое значение для изучения различных физиологических или патологических процессов во всех живых организмах. Таким образом, разработка клонируемых меток, которые можно использовать в качестве зондов электронной микроскопии, имеет большое значение, так же как флуоресцентные белки сыграли решающую роль в области оптической визуализации. Недавно был обнаружен механизм подавления аутонуклеации (ANSM), который позволяет осуществлять специфический синтез наночастиц золота (AuNP) на богатых цистеином метках, таких как металлотионеин (МТ) и антифризный белок (АФП).

На основе ANSM была разработана технология электронной микроскопии маркировки, которая позволяет специфически обнаруживать меченые белки в прокариотических и эукариотических клетках с беспрецедентной эффективностью мечения. Это исследование иллюстрирует протокол обнаружения слитых белков MTn (модифицированный вариант MT, в котором отсутствуют альдегид-реакционноспособные остатки) в клетках млекопитающих с хорошо сохранившейся ультраструктурой. В этом протоколе замораживание под высоким давлением и фиксация замораживанием выполнялись с использованием неальдегидных фиксаторов (таких как дубильная кислота, уранилацетат) для сохранения почти нативной ультраструктуры и предотвращения повреждения активности метки, вызванного альдегидным сшиванием.

Простая одностадийная регидратация использовалась до синтеза AuNP на основе ANSM. Результаты показали, что меченые белки нацелены на различные органеллы, включая мембраны и просвет эндоплазматического ретикулума (ER), а митохондриальные матрицы были обнаружены с высокой эффективностью и специфичностью. Это исследование предоставляет биологам надежный протокол для решения огромного круга биологических вопросов на уровне одной молекулы в клеточном ультраструктурном контексте.