Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה סינכרונית ורישום משותף של אירועי איתות תוך תאיים והפרשת אינסולין וגלוקגון על ידי פסאודואיסטים אנושיים ראשוניים באמצעות העברה אדנו-ויראלית של ביו-סנסור מחזורי אדנוזין מונופוספט (cAMP), גלאי הפרשי cAMP באתרו (cADDis) ומערכת מיקרופריפיוזיה.

Abstract

איי הלבלב של לנגרהנס, שהם אוספים תלת-ממדיים קטנים של תאים אנדוקריניים ותומכים מיוחדים הפזורים ברחבי הלבלב, הם בעלי תפקיד מרכזי בשליטה על הומאוסטזיס גלוקוז באמצעות הפרשת אינסולין על ידי תאי בטא, אשר מוריד את רמת הגלוקוז בדם, וגלוקגון על ידי תאי אלפא, אשר מעלה את רמת הגלוקוז בדם. מסלולי איתות תוך-תאיים, כולל אלה המתווכים על-ידי cAMP, חיוניים להפרשת הורמוני אלפא ובטא מוסדרים. מבנה האיון התלת-ממדי, אף שהוא חיוני לתפקוד מתואם של האיונים, מציב אתגרים ניסיוניים למחקרים מכניסטיים של מסלולי האיתות התוך-תאיים בתאי איון אנושיים ראשוניים. כדי להתגבר על אתגרים ומגבלות אלה, פרוטוקול זה מתאר דימות משולב של תאים חיים ופלטפורמה מיקרופלואידית באמצעות פסאודואיסטים אנושיים ראשוניים שנוצרו מתורמים ללא סוכרת הדומים לאיונים מקומיים במורפולוגיה, בהרכב ובתפקוד שלהם. פסאודואיסטים אלה נשלטים בגודל באמצעות תהליך הפיזור והצבירה מחדש של תאי איון אנושיים ראשוניים. במצב המפוזר, ביטוי גנים של תאי איון יכול להיות מניפולציה; לדוגמה, ניתן להציג ביו-חיישנים כגון cAMP biosensor המקודד גנטית, cADDis. לאחר היווצרותם, פסאודואיסטים המבטאים ביו-סנסור מקודד גנטית, בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי ופלטפורמת מיקרופריפוזיה, מאפשרים הערכה סינכרונית של דינמיקה של ביו-חיישנים פלואורסצנטיים ופרופילי הפרשת הורמוני אלפא ובטא כדי לספק תובנה רבה יותר לגבי תהליכים ותפקוד תאיים.

Introduction

האיים של לנגרהנס הם מיני איברים המפוזרים ברחבי הלבלב שתפקידם חיוני לשמירה על הומאוסטזיס גלוקוז. אינסולין מופרש מתאי בטא בעקבות חילוף חומרים של גלוקוז, עלייה ביחס ATP/ADP, סגירת תעלות אשלגן רגישות ל-ATP, דפולריזציה של קרום הפלזמה וזרימה של סידן1 חוץ-תאי. הפרשת גלוקגון מתאי אלפא מובנת פחות, אך הועלתה השערה כי מסלולים תוך-תאיים ופרקריניים תורמים לאקסוציטוזה של גרגרי גלוקגון 2,3,4. הן סוכרת מסוג 1 והן סוכרת מסוג 2 קשורות לתפקוד לקוי של תאי איון 5,6,7. לכן, הבהרת מ....

Protocol

איים אנושיים (N = 4 תכשירים) הושגו באמצעות שותפויות עם תוכנית ההפצה המשולבת של האיים, תוכנית ניתוח הלבלב האנושי, מעבדות פרודו בע"מ ואימג'ין פארמה. ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת ונדרבילט אינה מתייחסת לדגימות לבלב אנושיות לא מזוהות כמחקר בבני אדם. עבודה זו לא הייתה מתאפשרת ללא תורמי איברי.......

Representative Results

פסאודואיסטים אנושיים המבטאים ביוסנסורים נוצרו באמצעות העברה אדנו-ויראלית של מבנים המקודדים את cAMP biosensor cADDis (איור 1A). איור 1B מראה את הצבירה מחדש של תאי איון אנושי מותמרים לאורך זמן, כאשר פסאודואיסטים שנוצרו במלואם נצפו לאחר 6 ימי תרבית. התאים החלו להראות.......

Discussion

השילוב של מערכת מיקרופריפוזיה, פסאודואיסטים המבטאים חיישנים ביולוגיים ומיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר מאפשר הערכה סינכרונית של אירועי איתות תוך תאיים ופרופילי הפרשת הורמונים דינמיים. מערכת המיקרופריפוזיה הדינמית יכולה לספק סדרה של גירויים מוגדרים היטב לפסאודואיסטים ומאפשרת איסוף קול?.......

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

תורמי איברים ובני משפחותיהם זוכים להערכה על תרומותיהם שלא יסולא בפז, והמכון הבינלאומי לארגונים לרכישת איברים, קידום הרפואה (IIAM) והבורסה הלאומית לחקר מחלות (NDRI) מוכרים על שותפותם בהנגשת רקמת הלבלב האנושית למחקר. עבודה זו נתמכה על ידי רשת המחקר של האי האנושי (RRID:SCR_014393), התוכנית לניתוח לבלב אנושי (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 ו-DK20593 (מרכז המחקר וההדרכה לסוכרת ונדרבילט), קרן הצדקה ע"ש ליאונה מ. והארי ב. הלמסלי, JDRF, המחלקה לענייני חיילים משוחררים של ארה"ב (BX000666), NIGMS של המכונים הלאומיים לבריאות (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830, ואת הקרן הלאומית למחקר בוגר מ....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ad-CMV-cADDisWelgenNot applicable
 0.01” FEP tubingIDEX1527L
1 M HEPESGibco15630-080Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubesAnyAny
10 μm PTFE filterCole-ParmerSK-21940-41Change every 8-10 runs
100 mM Sodium PyruvateThermo Scientific11360070Enriched-CMRL Media Component
190 proof EthanolDecon labs2816Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I SupplementGibco35050061Enriched-CMRL Media Component
AscorbateSigmaA5960DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum AlbuminSigmaA7888DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap Omnifit006BT
CellCarrier ULA 96-well MicroplatesPerkin Elmer6055330
cellSens analysis softwareOlympusv3.1Software used for data analysis
CMRL 1066MediaTech 15-110-CVEnriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)IDEXP-794
D-(+)-GlucoseSigmaG7528Glucose Buffer Component
DMEM SigmaD5030DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamberokolabIX83
Epinepherine (Epi)SigmaE4250Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat InactivatedSigma12306CEnriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISAMercodia10-1281-01
Glucagon Kit HTRFCisbio62CGLPEH
HCl (12N)AnyAnyAcid Ethanol Component
HEPESSigmaH7523DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium SupplementCell DynamicsM1019iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24Cole-ParmerEW-00414-LW
Insulin ELISAMercodia10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)SigmaI5879Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscopeOlympusFV3000
L-GlutamineSigmaG8540DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)University of MiamiFP-3W
Microchip holder Micronit MicrofluidicsFC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction CollectorBiorad7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tipsAnyAny
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump InstechP720
Phosphate Buffered SalineGibco14190-144Wash Islets
Sarstedt dishesSarstedtdepends on dish diameter
Sodium BicarbonateSigmaS6014DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium PyruvateSigmaP2256 DMEM Perifusion Buffer Component
StereoscopeOlympusSZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)MilliporeSCGP00525Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete KitLifeLine Cell TechnologyLL-0003iEC Media Component

References

  1. Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
  2. Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glu....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved