מערכת פסאודואיסלט אנושית להערכה סינכרונית של דינמיקה ביו-חיישנית פלואורסצנטית ופרופילי הפרשת הורמונים

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה סינכרונית ורישום משותף של אירועי איתות תוך תאיים והפרשת אינסולין וגלוקגון על ידי פסאודואיסטים אנושיים ראשוניים באמצעות העברה אדנו-ויראלית של ביו-סנסור מחזורי אדנוזין מונופוספט (cAMP), גלאי הפרשי cAMP באתרו (cADDis) ומערכת מיקרופריפיוזיה.

Abstract

איי הלבלב של לנגרהנס, שהם אוספים תלת-ממדיים קטנים של תאים אנדוקריניים ותומכים מיוחדים הפזורים ברחבי הלבלב, הם בעלי תפקיד מרכזי בשליטה על הומאוסטזיס גלוקוז באמצעות הפרשת אינסולין על ידי תאי בטא, אשר מוריד את רמת הגלוקוז בדם, וגלוקגון על ידי תאי אלפא, אשר מעלה את רמת הגלוקוז בדם. מסלולי איתות תוך-תאיים, כולל אלה המתווכים על-ידי cAMP, חיוניים להפרשת הורמוני אלפא ובטא מוסדרים. מבנה האיון התלת-ממדי, אף שהוא חיוני לתפקוד מתואם של האיונים, מציב אתגרים ניסיוניים למחקרים מכניסטיים של מסלולי האיתות התוך-תאיים בתאי איון אנושיים ראשוניים. כדי להתגבר על אתגרים ומגבלות אלה, פרוטוקול זה מתאר דימות משולב של תאים חיים ופלטפורמה מיקרופלואידית באמצעות פסאודואיסטים אנושיים ראשוניים שנוצרו מתורמים ללא סוכרת הדומים לאיונים מקומיים במורפולוגיה, בהרכב ובתפקוד שלהם. פסאודואיסטים אלה נשלטים בגודל באמצעות תהליך הפיזור והצבירה מחדש של תאי איון אנושיים ראשוניים. במצב המפוזר, ביטוי גנים של תאי איון יכול להיות מניפולציה; לדוגמה, ניתן להציג ביו-חיישנים כגון cAMP biosensor המקודד גנטית, cADDis. לאחר היווצרותם, פסאודואיסטים המבטאים ביו-סנסור מקודד גנטית, בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי ופלטפורמת מיקרופריפוזיה, מאפשרים הערכה סינכרונית של דינמיקה של ביו-חיישנים פלואורסצנטיים ופרופילי הפרשת הורמוני אלפא ובטא כדי לספק תובנה רבה יותר לגבי תהליכים ותפקוד תאיים.

Introduction

האיים של לנגרהנס הם מיני איברים המפוזרים ברחבי הלבלב שתפקידם חיוני לשמירה על הומאוסטזיס גלוקוז. אינסולין מופרש מתאי בטא בעקבות חילוף חומרים של גלוקוז, עלייה ביחס ATP/ADP, סגירת תעלות אשלגן רגישות ל-ATP, דפולריזציה של קרום הפלזמה וזרימה של סידן¹ חוץ-תאי. הפרשת גלוקגון מתאי אלפא מובנת פחות, אך הועלתה השערה כי מסלולים תוך-תאיים ופרקריניים תורמים לאקסוציטוזה של גרגרי גלוקגון ^2,3,4. הן סוכרת מסוג 1 והן סוכרת מסוג 2 קשורות לתפקוד לקוי של תאי איון ^5,6,7. לכן, הבהרת מ....

Protocol

איים אנושיים (N = 4 תכשירים) הושגו באמצעות שותפויות עם תוכנית ההפצה המשולבת של האיים, תוכנית ניתוח הלבלב האנושי, מעבדות פרודו בע"מ ואימג'ין פארמה. ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת ונדרבילט אינה מתייחסת לדגימות לבלב אנושיות לא מזוהות כמחקר בבני אדם. עבודה זו לא הייתה מתאפשרת ללא תורמי איברי.......

Discussion

השילוב של מערכת מיקרופריפוזיה, פסאודואיסטים המבטאים חיישנים ביולוגיים ומיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר מאפשר הערכה סינכרונית של אירועי איתות תוך תאיים ופרופילי הפרשת הורמונים דינמיים. מערכת המיקרופריפוזיה הדינמית יכולה לספק סדרה של גירויים מוגדרים היטב לפסאודואיסטים ומאפשרת איסוף קול?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component