A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה סינכרונית ורישום משותף של אירועי איתות תוך תאיים והפרשת אינסולין וגלוקגון על ידי פסאודואיסטים אנושיים ראשוניים באמצעות העברה אדנו-ויראלית של ביו-סנסור מחזורי אדנוזין מונופוספט (cAMP), גלאי הפרשי cAMP באתרו (cADDis) ומערכת מיקרופריפיוזיה.
איי הלבלב של לנגרהנס, שהם אוספים תלת-ממדיים קטנים של תאים אנדוקריניים ותומכים מיוחדים הפזורים ברחבי הלבלב, הם בעלי תפקיד מרכזי בשליטה על הומאוסטזיס גלוקוז באמצעות הפרשת אינסולין על ידי תאי בטא, אשר מוריד את רמת הגלוקוז בדם, וגלוקגון על ידי תאי אלפא, אשר מעלה את רמת הגלוקוז בדם. מסלולי איתות תוך-תאיים, כולל אלה המתווכים על-ידי cAMP, חיוניים להפרשת הורמוני אלפא ובטא מוסדרים. מבנה האיון התלת-ממדי, אף שהוא חיוני לתפקוד מתואם של האיונים, מציב אתגרים ניסיוניים למחקרים מכניסטיים של מסלולי האיתות התוך-תאיים בתאי איון אנושיים ראשוניים. כדי להתגבר על אתגרים ומגבלות אלה, פרוטוקול זה מתאר דימות משולב של תאים חיים ופלטפורמה מיקרופלואידית באמצעות פסאודואיסטים אנושיים ראשוניים שנוצרו מתורמים ללא סוכרת הדומים לאיונים מקומיים במורפולוגיה, בהרכב ובתפקוד שלהם. פסאודואיסטים אלה נשלטים בגודל באמצעות תהליך הפיזור והצבירה מחדש של תאי איון אנושיים ראשוניים. במצב המפוזר, ביטוי גנים של תאי איון יכול להיות מניפולציה; לדוגמה, ניתן להציג ביו-חיישנים כגון cAMP biosensor המקודד גנטית, cADDis. לאחר היווצרותם, פסאודואיסטים המבטאים ביו-סנסור מקודד גנטית, בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי ופלטפורמת מיקרופריפוזיה, מאפשרים הערכה סינכרונית של דינמיקה של ביו-חיישנים פלואורסצנטיים ופרופילי הפרשת הורמוני אלפא ובטא כדי לספק תובנה רבה יותר לגבי תהליכים ותפקוד תאיים.
האיים של לנגרהנס הם מיני איברים המפוזרים ברחבי הלבלב שתפקידם חיוני לשמירה על הומאוסטזיס גלוקוז. אינסולין מופרש מתאי בטא בעקבות חילוף חומרים של גלוקוז, עלייה ביחס ATP/ADP, סגירת תעלות אשלגן רגישות ל-ATP, דפולריזציה של קרום הפלזמה וזרימה של סידן1 חוץ-תאי. הפרשת גלוקגון מתאי אלפא מובנת פחות, אך הועלתה השערה כי מסלולים תוך-תאיים ופרקריניים תורמים לאקסוציטוזה של גרגרי גלוקגון 2,3,4. הן סוכרת מסוג 1 והן סוכרת מסוג 2 קשורות לתפקוד לקוי של תאי איון 5,6,7. לכן, הבהרת מ....
איים אנושיים (N = 4 תכשירים) הושגו באמצעות שותפויות עם תוכנית ההפצה המשולבת של האיים, תוכנית ניתוח הלבלב האנושי, מעבדות פרודו בע"מ ואימג'ין פארמה. ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת ונדרבילט אינה מתייחסת לדגימות לבלב אנושיות לא מזוהות כמחקר בבני אדם. עבודה זו לא הייתה מתאפשרת ללא תורמי איברי.......
פסאודואיסטים אנושיים המבטאים ביוסנסורים נוצרו באמצעות העברה אדנו-ויראלית של מבנים המקודדים את cAMP biosensor cADDis (איור 1A). איור 1B מראה את הצבירה מחדש של תאי איון אנושי מותמרים לאורך זמן, כאשר פסאודואיסטים שנוצרו במלואם נצפו לאחר 6 ימי תרבית. התאים החלו להראות.......
השילוב של מערכת מיקרופריפוזיה, פסאודואיסטים המבטאים חיישנים ביולוגיים ומיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר מאפשר הערכה סינכרונית של אירועי איתות תוך תאיים ופרופילי הפרשת הורמונים דינמיים. מערכת המיקרופריפוזיה הדינמית יכולה לספק סדרה של גירויים מוגדרים היטב לפסאודואיסטים ומאפשרת איסוף קול?.......
תורמי איברים ובני משפחותיהם זוכים להערכה על תרומותיהם שלא יסולא בפז, והמכון הבינלאומי לארגונים לרכישת איברים, קידום הרפואה (IIAM) והבורסה הלאומית לחקר מחלות (NDRI) מוכרים על שותפותם בהנגשת רקמת הלבלב האנושית למחקר. עבודה זו נתמכה על ידי רשת המחקר של האי האנושי (RRID:SCR_014393), התוכנית לניתוח לבלב אנושי (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 ו-DK20593 (מרכז המחקר וההדרכה לסוכרת ונדרבילט), קרן הצדקה ע"ש ליאונה מ. והארי ב. הלמסלי, JDRF, המחלקה לענייני חיילים משוחררים של ארה"ב (BX000666), NIGMS של המכונים הלאומיים לבריאות (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830, ואת הקרן הלאומית למחקר בוגר מ....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
Environmental chamber | okolab | IX83 | |
Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
Peristaltic pump | Instech | P720 | |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved