저자는 인간 폐 조달을 위한 UVM 부검 서비스와 전반적인 해부 기술에 기여한 Robert Pouliot 박사에게 감사드립니다. 이러한 연구는 R01 HL127144-01(DJW)에 의해 뒷받침되었습니다.

모든 동물 연구는 버몬트 대학교(UVM)의 IACUC에 따라 수행되었습니다. 모든 인간 폐는 UVM 부검 서비스에서 획득했으며 관련 연구는 UVM의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
참고: 돼지 및 인간 폐의 탈세포화는 이전에 우리 그룹 7,8,9,10,21에 의해 설명되었습니다....

세포-세포 및 세포-ECM 상호 작용을 연구하기 위한 지역 탈세포 폐 조직 분리

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	<li>L&#243;pez-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+COPD.">Global burden of COPD.</a> Respirology. 21 (1), 14-23 (2016).</li><li>Raherison, C., Girodet, P. -. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+COPD.">Epidemiology of COPD.</a> European Respiratory Review. 18 (114), 213-221 (2009).</li><li>Glass, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+pulmonary+fibrosis:+Current+and+future+treatment.">Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment.</a> The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).</li><li>Dickinson, K. M., Collaco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+Fibrosis.">Cystic Fibrosis.</a> Pediatrics in Review. 42 (2), 55-67 (2021).</li><li>DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complications+of+lung+transplantation:+update+on+imaging+manifestations+and+management.">Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management.</a> Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252 (2021).</li><li>Young, K. A., Dilling, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+lung+transplantation.">The future of lung transplantation.</a> Chest. 155 (3), 465-473 (2019).</li><li>Wagner, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+decellularization+and+recellularization+of+normal+versus+emphysematous+human+lungs.">Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs.</a> Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).</li><li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation.">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).</li><li>Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+decellularized+lung+matrices+for+cell+culture+and+protein+analysis.">Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).</li><li>Wagner, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+of+acellular+human+and+porcine+lungs+for+high+throughput+studies+of+lung+disease+and+regeneration.">Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration.</a> Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).</li><li>Uhl, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+glycosaminoglycans+in+decellularized+lung+extracellular+matrix.">Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix.</a> Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).</li><li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues:+structure+and+function.">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li><li>Giobbe, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+hydrogel+derived+from+decellularized+tissues+enables+endodermal+organoid+culture.">Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture.</a> Nature Communications. 10 (1), 5658 (2019).</li><li>Petrou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clickable+decellularized+extracellular+matrix+as+a+new+tool+for+building+hybrid-hydrogels+to+model+chronic+fibrotic+diseases+in+vitro.">Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro.</a> Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).</li><li>Nizamoglu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+fibrosis+using+crosslinked+native+extracellular+matrix-derived+hydrogels+to+modulate+biomechanics+without+changing+composition.">An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition.</a> Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).</li><li>Marhuenda, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+extracellular+matrix+hydrogels+enhance+preservation+of+type+ii+phenotype+in+primary+alveolar+epithelial+cells.">Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888 (2022).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+tissue+extracellular+matrix-derived+hydrogels+protect+against+radiation-induced+lung+injury+by+suppressing+epithelial-mesenchymal+transition.">Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).</li><li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel.">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li><li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+lung-derived+extracellular+matrix+hydrogel+properties+are+dependent+on+pepsin+digestion+time.">Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).</li><li>de Hilster, R. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lung+extracellular+matrix+hydrogels+resemble+the+stiffness+and+viscoelasticity+of+native+lung+tissue.">Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).</li><li>Hoffman, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+and+disease+specific+human+lung+extracellular+matrix+composition.">Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition.</a> Biomaterials. 293, 121960 (2023).</li><li>Sicard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+anatomical+variations+in+lung+tissue+stiffness.">Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).</li></ol>

인간 및 다른 종의 탈세포화된 조직은 3D 하이드로겔을 포함한 생체 외 배양 모델에서 ECM 구성 및 세포-ECM 상호작용을 연구하기 위한 생체 재료로 자주 활용됩니다12,13. 다른 기관과 유사하게, 탈세포화된 폐는 이전에 건강한 폐와 병든(즉, 폐기종 및 IPF) 폐의 ECM 구성 차이를 결정하는 데 사용되었으며 ECM 역학 및 세포-ECM 상호작용을 연구하기 위?...

만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 특발성 폐섬유증(IPF) 및 낭포성 섬유증(CF)을 포함한 폐질환은 현재 치료법이 없는 상태로 남아 있다 1,2,3,4. 폐 이식은 종종 후기 단계의 환자에게 유일한 옵션이지만, 적절한 기증자 폐의 공급과 이식 후 급성 및 만성 거부 반응으로 인해 제한된 옵션으로 남아 있습니다 3,5,6. 따라서 새로운 치료 전략이 절실히 필요합니다. 호흡기 생명 공학에서 한 가지 유망한 접근 방식은 탈세포화된 천연 폐 조직에서 제조된 조직 유래 스캐폴드의 적용입니다. 무세포 전체 폐 스캐폴드는 천연 세포외 기질(ECM) 조성 및 생체 활성의 복잡성을 많이 유지하므로 전체 장기 공학 및 폐 질환 메커니즘연구를 위한 개선된 모델로 집중적으로 연구되었습니다 7,8,9,10. 이와 동시에, 오가노이드 및 기타 조직 배양 모델에서 세포-세포 및 세포-ECM 상호작용을 연구하기 위한 하이드로겔 및 기타 기질로서 폐를 포함한 다양한 기관의 탈세포화된 조직을 활용하는 것에 대한 관심이 증가하고 있습니다 11,12,13,14,15,16,17. 이들은 종양 공급원에서 파생된 Matrigel과 같은 상업적으로 이용 가능한 기질보다 더 관련성이 높은 모델을 제공합니다. 그러나 현재 인간 폐 유래 하이드로겔에 대한 정보는 상대적으로 제한적입니다. 우리는 이전에 탈세포화된 돼지 폐에서 유래한 하이드로겔에 대해 설명했으며 기계적 및 물질적 특성을 모두 특성화했으며 세포 배양 모델로서의 유용성을 입증했습니다18,19. 최근 보고서는 탈세포화된 정상 및 질병(COPD, IPF) 인간 폐에서 유래한 하이드로겔의 초기 기계적 및 점탄성 특성을 자세히 설명했습니다20. 우리는 또한 탈세포화된 정상 및 COPD 인간 폐의 글리코사미노글리칸 함량을 특성화하는 초기 데이터와 세포-세포 및 세포-ECM 상호작용 연구에 대한 적용 가능성을 제시했습니다11.
이러한 예는 탈세포화된 인간 폐 ECM을 조사 목적으로 활용하는 힘을 보여줍니다. 그러나 폐는 복잡한 기관이며 ECM 구성 및 강성과 같은 기타 특성을 포함하여 폐의 다른 영역에서 구조와 기능이 모두 다릅니다21,22. 따라서 기관 및 대기도, 중형 및 소기도, 폐포, 대형, 중형 및 소혈관을 포함한 폐의 개별 영역에서 ECM을 연구하는 것이 중요합니다. 이를 위해 우리는 탈세포화된 인간과 돼지의 폐를 해부하고 이후에 각각의 해부학적 영역을 분리하기 위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 개발했습니다. 이를 통해 정상 폐와 병든 폐 모두에서 국소 단백질 함량을 세부적으로 차등적으로 분석할 수 있었다21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm</td>
			<td>CellPath</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Iris Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11373-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Glass Casserole Dish</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>3175-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and isolation of region-specific decellularized lung tissue

폐 이식은 종종 중증 폐 질환의 후기 단계에 있는 환자에게 유일한 옵션이지만 적절한 기증자 폐의 공급과 이식 후 급성 및 만성 거부 반응으로 인해 제한적입니다. 병든 폐를 대체하기 위한 새로운 생명공학적 접근법을 확인하는 것은 환자 생존율을 개선하고 현재 이식 방법론과 관련된 합병증을 피하는 데 필수적입니다. 대안적인 접근법은 일반적으로 급성 및 만성 거부 반응의 원인인 세포 성분이 결여된 탈세포화된 전체 폐를 사용하는 것입니다. 폐는 매우 복잡한 기관이기 때문에 혈관계, 기도 및 폐포 조직을 포함한 특정 영역의 세포외 기질 성분을 검사하는 것이 중요합니다. 이 접근법의 목적은 연구자들이 완전히 탈세포화된 폐에서 지역별 조직을 해부하고 분리할 수 있는 간단하고 재현 가능한 방법을 확립하는 것입니다. 현재 프로토콜은 돼지와 인간의 폐를 위해 고안되었지만 다른 종에도 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜을 위해 조직의 4개 영역(기도, 혈관계, 폐포 및 벌크 폐 조직)을 지정했습니다. 이 절차를 통해 기존의 대량 분석 방법과 달리 탈세포화된 폐 조직의 내용물을 보다 정확하게 나타내는 조직 샘플을 조달할 수 있습니다.

Lung diseases, including chronic obstructive pulmonary disease (COPD), idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), and cystic fibrosis (CF), currently remain without a cure1,2,3,4. Lung transplantation is often the only option for patients in later stages, however this remains a limited option both due to the supply of suitable donor lungs and both acute and chronic rejection after transplantation3,5,6. As such, there is a critical need for new treatment strategies. One promising approach in respiratory bioengineering is the application of tissue-derived scaffolds prepared from decellularized native lung tissue. As acellular whole lung scaffolds retain much of the complexity of the native extracellular matrix (ECM) composition and bioactivity, they have been intensively studied for whole-organ engineering and as improved models for studying lung disease mechanisms7,8,9,10. In parallel, there is increasing interest in utilizing decellularized tissues from different organs, including lungs, as hydrogels and other substrates for studying cell-cell and cell-ECM interactions in organoid and other tissue culture models11,12,13,14,15,16,17. These provide more relevant models than commercially available substrates, such as Matrigel, derived from tumor sources. However, information on human lung-derived hydrogels is relatively limited at present. We have previously described hydrogels derived from decellularized pig lungs and have characterized both their mechanical and material properties, as well as demonstrated their utility as cell culture models18,19.&#160;A recent report detailed the initial mechanical and viscoelastic characterization of hydrogels derived from decellularized normal and diseased (COPD, IPF) human lungs20. We have also presented initial data characterizing the glycosaminoglycan content of decellularized normal and COPD human lungs, as well as their applicability for studying cell-cell and cell-ECM interactions11.
These examples illustrate the power of utilizing decellularized human lung ECMs for investigative purposes. However, the lung is a complex organ, and both the structure and function vary in different regions of the lung, including ECM composition and other properties such as stiffness21,22. As such, it is of interest to study the ECM in individual regions of the lung, including the trachea and large airways, medium-sized and small airways, and alveoli, as well as large, medium-sized, and small blood vessels. To this end, we have developed a reliable and reproducible method for dissecting decellularized human and pig lungs and subsequently isolating each of those anatomic regions. This has allowed detailed differential analysis of regional protein content in both normal and diseased lungs21.

저자 스포트라이트: Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue  

지역별 탈세포화된 폐 조직의 해부 및 분리

Decellularized organs are continually being used in a variety of tissue engineering applications. However, most of these studies consider the organ as a whole and not the individual anatomical regions. We developed this method to look at individual anatomical regions of decellularized human lungs for more precise model systems for downstream applications.When developing model systems, it's important to consider different design aspects so that your system best recapitulates normal biology. For the lung, this includes factors such as environmental stress, cyclic mechanical stress, and elasticity, which may differ between independent regions of the lung. Utilizing this method, we've been able to show that the extracellular matrix derived from individual anatomical lung regions from both healthy and diseased lungs have distinct proteomic signatures.This allows us to further understand lung disease and potentially come up with novel therapeutic avenues. To continue with this research, our lab is currently developing three-dimensional hydrogels from healthy and diseased lung extracellular matrix. These hydrogels allow us to perform in vitro organoid modeling in order to elucidate the role of extracellular matrix interactions on corresponding cell behavior.

프로토콜의 전체 회로도는 그림 1에 나와 있습니다. 일단 숙달되면 탈세포화된 폐 조직의 국소 해부를 쉽게 재현할 수 있습니다. 절단된 각 조직 샘플의 분류를 결정하는 것은 해부 절차의 성공에 필수적입니다. 혈관 조직은 기도보다 훨씬 더 탄력적이므로 집게를 사용하여 조직을 늘리는 것은 종종 특정 샘플이 혈관 구조인지 기도인지에 대한 강력한 지표입니다. 전형적으?...

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여기에 제시된 것은 국소 탈세포화된 폐 조직의 분리를 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 세포외 기질 및 세포-기질 상호 작용의 복잡성을 연구하기 위한 강력한 도구를 제공합니다.

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...

탈세포화된 장기는 다양한 조직 공학 응용 분야에서 지속적으로 사용되고 있습니다. 그러나 이러한 연구의 대부분은 개별 해부학 적 영역이 아닌 장기 전체를 고려합니다. 우리는 다운스트림 응용 분야를 위한 보다 정확한 모델 시스템을 위해 탈세포화된 인간 폐의 개별 해부학적 영역을 살펴보기 위해 이 방법을 개발했습니다.모델 시스템을 개발할 때 시스템이 정상적인 생물학을 가장 잘 요약할 수 있도록 다양한 설계 측면을 고려하는 것이 중요합니다. 폐의 경우 여기에는 환경 스트레스, 주기적 기계적 스트레스 및 탄성과 같은 요인이 포함되며, 이는 폐의 독립 영역마다 다를 수 있습니다. 이 방법을 활용하여 우리는 건강한 폐와 병든 폐 모두의 개별 해부학적 폐 영역에서 파생된 세포외 기질이 뚜렷한 프로테오믹 시그니처를 가지고 있음을 보여줄 수 있었습니다.이를 통해 우리는 폐 질환을 더 깊이 이해하고 잠재적으로 새로운 치료 방법을 제시할 수 있습니다. 이 연구를 계속하기 위해 우리 연구실은 현재 건강하고 병든 폐 세포 외 기질에서 3 차원 하이드로 겔을 개발하고 있습니다. 이러한 하이드로겔을 사용하면 해당 세포 행동에 대한 세포외 기질 상호 작용의 역할을 설명하기 위해 시험관 내 오가노이드 모델링을 수행할 수 있습니다.

지역별 탈세포화된 폐 조직의 해부 및 분리

Abstract