TAGGGテロメア長アッセイの性能パラメータの最適化

ここでは、非放射性化学発光検出を用いてテロメア長を定量するためのプロトコルについて、TAGGGテロメア長アッセイキットの様々な性能パラメータ(緩衝液量やプローブ濃度など)の最適化を中心に詳細に説明する。

テロメアは染色体末端に存在する反復配列です。それらの短縮はヒト体細胞の特徴です。短縮は、末端複製の問題およびテロメア長の維持に関与するテロメラーゼ酵素の欠如のために起こる。興味深いことに、テロメアは、汚染物質、感染性病原体、栄養素、放射線などの細胞外因子によって影響を受ける可能性のある酸化ストレスや炎症などのさまざまな内部生理学的プロセスに応答して短くなります。したがって、テロメア長は、老化および様々な生理学的健康パラメータの優れたバイオマーカーとして役立つ。TAGGGテロメア長アッセイキットは、テロメア制限フラグメント(TRF)アッセイを使用して平均テロメア長を定量するために使用され、再現性が高いです。ただし、これは高価な方法であり、このため、サンプル数が多い場合は日常的に採用されていません。ここでは、サザンブロットまたはTRF分析と非放射性化学発光ベースの検出を使用して、テロメア長を最適化して費用対効果の高い測定を行うための詳細なプロトコルについて説明します。

テロメアは、染色体の末端に存在する反復DNA配列です。それらはTTAGGGのタンデムリピートを持ち、染色体をほつれと末端複製の問題の両方から保護することによってゲノムの完全性を維持します、それは3'オーバーハングの一部がDNAポリメラーゼ^1,2によって複製できないことを意味します。短いテロメアは細胞の染色体異常を引き起こし、そのため細胞は複製老化³と呼ばれる段階で永久に停止します。短いテロメアは、ミトコンドリア機能障害^4,5や細胞機能障害など、他の多くの問題も引き起こします。

DNAテロメアの繰り返しは、細胞が分裂すると失われ、年間平均25〜200 bpの損失6、一定数の分裂後に細胞老化が生じます⁶。老化は併存疾患の頻度が高くなり、テロメアの長さ^が短くなるのが特徴です7。Menderによって記述されているように、テロメア制限フラグメント(TRF)分析は非常に高価な方法です⁸。このため、ほとんどの研究ではテロメ....

注:以下のプロトコルで使用されるすべての試薬の詳細については、 材料の表 を参照してください。表 1 はラボ製の試薬と最適化された容量を記載し、 表2 は市販の試薬の使用濃度を示しています。

1. 細胞培養

1. テロメア長を測定する細胞(ここでは卵巣腺癌細胞株であるA2780細胞を使用)を、10%ウシ胎児血清(FBS)、?.......

抽出したゲノムDNA(gDNA)を1%アガロースゲルで実行したところ、 図1Bに示すように良好な完全性を示し、サンプルをTRFのさらなるダウンストリーム処理に使用できることを示しています。次いで、TRFアッセイは、各工程で必要な溶液の量を改変することによって実施した(表 1 および 表2を参照されたい)。TRF信号ははっきりと見えました(

サザンブロッティングを用いたテロメア長測定のための非放射性化学発光ベースの方法の詳細な手順について説明します。このプロトコルは、結果の品質を損なうことなく、いくつかの試薬を賢明に使用できるようにテストされています。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションバッファーは、最大5回まで再利用することができる。酵素濃度は、結果に影響を与えること.......

プロトコルの最適化を最初に手伝ってくれたPrachi Shahさんに感謝します。A2780卵巣がん細胞株を提供してくださったManoj Garg博士に感謝します。EKは、バイオテクノロジー部門(No. BT/RLF/Re-entry/06/2015)、科学技術部門(ECR/2018/002117)、およびNMIMSシードグラント(IO 401405)からの研究助成金によってサポートされています。