Optimering av prestandaparametrar för TAGGG-telomerlängdanalysen

Här beskriver vi i detalj protokollet för kvantifiering av telomerlängd med hjälp av icke-radioaktiv kemiluminescerande detektion, med fokus på optimering av olika prestandaparametrar för TAGGG-telomerlängdanalyssatsen, såsom buffertkvantiteter och sondkoncentrationer.

Telomerer är repetitiva sekvenser som är närvarande vid kromosomala ändar; Deras förkortning är ett karakteristiskt drag hos humana somatiska celler. Förkortning uppstår på grund av ett problem med slutreplikation och frånvaron av telomerasenzymet, som är ansvarigt för att upprätthålla telomerlängden. Intressant nog förkortas telomerer också som svar på olika interna fysiologiska processer, som oxidativ stress och inflammation, som kan påverkas på grund av extracellulära medel som föroreningar, smittämnen, näringsämnen eller strålning. Således tjänar telomerlängden som en utmärkt biomarkör för åldrande och olika fysiologiska hälsoparametrar. TAGGG-telomerlängdanalyssatsen används för att kvantifiera genomsnittliga telomerlängder med hjälp av telomerbegränsningsfragmentet (TRF) och är mycket reproducerbar. Det är dock en dyr metod, och på grund av detta används den inte rutinmässigt för stora provnummer. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för en optimerad och kostnadseffektiv mätning av telomerlängd med hjälp av Southern blots eller TRF-analys och icke-radioaktiv kemiluminiscensbaserad detektion.

Telomerer är de repetitiva DNA-sekvenserna som finns i slutet av kromosomerna. De har tandemupprepningar av TTAGGG och upprätthåller genomets integritet genom att skydda kromosomen från både slitage och slutreplikationsproblemet, vilket innebär att en del av 3'-överhänget inte kan replikeras av DNA-polymeras ^1,2. Korta telomerer leder till kromosomavvikelser i celler, på grund av vilka celler blir permanent arresterade i ett stadium som kallas replikativ åldrande³. Korta telomerer orsakar också en mängd andra problem, såsom mitokondrier dysfunktion ^4,5....

OBS: Se materialtabellen för detaljer om alla reagenser som används i protokollet nedan. Tabell 1 listar laboratorietillverkade reagens tillsammans med optimerade volymer och tabell 2 visar arbetskoncentrationer av kommersiellt tillgängliga reagens.

1. Cellodling

1. Underhålla celler vars telomerlängd ska mätas (används här var A2780-celler, som är en ovariell adenokarcinomcellinje) i Dulbeccos modifierade örn.......

Det extraherade genomiska DNA (gDNA), som kördes på en 1% agarosgel, visade god integritet, som visas i figur 1B, vilket indikerar att provet kan användas för vidare nedströms bearbetning av TRF. TRF-analysen utfördes sedan genom att ändra de volymer av lösningar som krävdes vid varje steg (se tabell 1 och tabell 2). TRF-signalen var tydligt synlig (figur 3). Således, genom att modifiera lösningsvolymerna och koncentr.......

Vi beskriver en detaljerad procedur för en icke-radioaktiv, kemiluminiscensbaserad metod för telomerlängdmätning med Southern blotting. Protokollet har testats för att tillåta förnuftig användning av flera reagens utan att kompromissa med resultatens kvalitet. Prehybridiserings- och hybridiseringsbufferten kan återanvändas upp till fem gånger. Enzymkoncentrationen kan variera mellan 10-20 U per 1,5-2 μg genomiskt DNA utan att påverka resultaten. Flera andra kitkomponenter, såsom den DIG-märkta molekylviktm.......

Vi vill tacka Prachi Shah för att hon hjälpte oss initialt med protokolloptimeringen. Vi vill tacka Dr. Manoj Garg för att tillhandahålla A2780 äggstockscancer cellinje. EK stöds av ett forskningsanslag från Institutionen för bioteknik (No. BT/RLF/Re-entry/06/2015), Institutionen för teknik och naturvetenskap (ECR/2018/002117) och NMIMS Seed Grant (IO 401405).