A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
שיטה לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים ממוחות של חולדות חיות מוצגת כאן בפירוט ניסיוני. הוא מאפשר אוספים מרובים של תאים אלה מאותם בעלי חיים מבלי לסכן את רווחתם.
תאי גזע עצביים ספציפיים לרקמות (NSCs) נשארים פעילים במוח של יונקים לאחר הלידה. הם מתגוררים בנישות מיוחדות, שם הם מייצרים נוירונים חדשים וגלריה. נישה אחת כזו היא האזור התת-אפנדימלי (SEZ; נקרא גם האזור החדרי-תת-חדרי), הממוקם מעבר לדפנות הצידיות של החדרים הרוחביים, בסמוך לשכבת התא האפנדימלי. תאי אב אוליגודנדרוציטים (OPC) מופצים בשפע ברחבי מערכת העצבים המרכזית, ומהווים מאגר של תאי אב מתרבים שיכולים לייצר אוליגודנדרוציטים.
הן NSCs והן OPCs מציגים פוטנציאל התחדשות עצמית ומחזורי שקט/הפעלה. בשל מיקומם, הבידוד והחקירה הניסויית של תאים אלה מבוצעת לאחר המוות. כאן, אנו מתארים בפירוט "חליבת מוח", שיטה לבידוד של תאי גזע גזעיים ו- OPC, בין תאים אחרים, מבעלי חיים חיים. זהו פרוטוקול דו-שלבי המיועד לשימוש במכרסמים ונבדק בחולדות. ראשית, תאים "משתחררים" מהרקמה באמצעות הזרקה סטריאוטקסית תוך-מוחית (i.c.v.) של "קוקטייל שחרור". המרכיבים העיקריים הם neuraminidase, אשר מכוון תאים אפנדימליים וגורם denudation דופן החדר, נוגדן חוסם integrin-β1, וגורם גדילה פיברובלסט-2. בשלב "איסוף" שני, ביופסיות נוזליות של נוזל מוחי שדרתי מבוצעות מגנה cisterna, בחולדות מורדמות ללא צורך בחתך.
התוצאות המוצגות כאן מראות כי תאים מבודדים שומרים על הפרופיל האנדוגני שלהם וכי NSCs של SEZ שומרים על שלוותם. הדנודציה של שכבת האפנדימל מוגבלת לרמה האנטומית של ההזרקה והפרוטוקול (שחרור ואיסוף) נסבל היטב על ידי בעלי החיים. גישה חדשנית זו סוללת את הדרך לביצוע מחקרי אורך של נוירוגנזה אנדוגנית וגליוגנזה בחיות ניסוי.
תאי גזע ספציפיים לרקמות הם תאים מחויבים חלקית שיכולים ליצור את כל אוכלוסיות התאים המרכיבות את הרקמות המתאימות. מלבד היותם מולטיפוטנטיים, הם תאים המתחדשים מעצמם וחיוניים לשמירה על ההומאוסטזיס ויכולת ההתחדשות של רקמות1. חלק מתאי הגזע הספציפיים לרקמות נשארים במצב פעיל ומתרבים מאוד, כגון תאי גזע במעי או בהמטופויטיקה. אחרים, כגון תאי גזע המוח, נשארים שקטים או רדומיםבמידה רבה 2. במוח הבוגר, תאי גזע עצביים (NSCs) יכולים להימצא באזורים מיוחדים, הנקראים לעתים קרובות נישות. שני אזורים כאלה המתוארים היטב קיימים באזור התת-אפנדימלי (SEZ) של החדרים הרוחביים ובפיתול המשונן של ההיפוקמפוס. נישת SEZ מייצרת את המספר הגבוה ביותר של תאים, בע....
הליכי גידול, תחזוקה וניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לחוק הבריטי לבעלי חיים (הליכים מדעיים) 1986, שאושר על ידי משרד הפנים, ועם הצו הנשיאותי 56/2013 של הרפובליקה ההלנית, שנבחן על ידי גופי רווחת בעלי החיים והביקורת האתית של אוניברסיטאות קיימברידג 'ופטרס, וכן אושר ונבדק על ידי הוועדה המקומית לטיפול ?.......
שחרור ואיסוף של NSCs
NSCs של SEZ מופרדים מן CSF רק על ידי monolayer של תאים ependymal, אם כי הם נשארים בקשר ישיר עם התוכן החדר באמצעות intercalating mono-ciliated תהליכים 8,9. Neuraminidase פועל באופן ספציפי על תאים ependymal באמצעות מחשוף של שאריות חומצה sialic והוא יכול לגרום denudatio.......
תאי גזע ותאי אב דלילים יחסית ברקמת המוח של יונקים. בנוסף, NSCs ממוקמים באזורים שאינם נגישים לביופסיות קלות ובטוחות (קירות חדר, היפוקמפוס). לכן, הדרך היחידה לעבוד באופן ניסיוני עם תאים כאלה, עד כה, הייתה הבידוד שלהם לאחר המוות. שיטה המאפשרת איסוף יחיד או חוזר של NSCs ו-OPC מחולדות חיות, הנקראת חליבה,.......
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר רפואי פעולה (בריטניה) (GN2291) ל- R.J.M.F. ו- I.K. עבודת המחקר נתמכה גם באופן חלקי (עלויות בעלי חיים ותמיכה ל- D.D) על ידי הקרן ההלנית למחקר וחדשנות (H.F.R.I.) תחת "קול קורא ראשון לפרויקטי מחקר של H.F.R.I לתמיכה בחברי סגל וחוקרים ורכישת מענק ציוד מחקר בעלות גבוהה" (מספר פרויקט: 3395).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Release cocktail | |||
β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
Surgical procedures | |||
10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
Tissue and cells handling and immunostainings | |||
96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
Cryostat | Leica | CM1510S | |
DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
EGF | Peprotech | 315-09 | |
FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
Triton X-100 | Merck | X100 | |
Microscopy and image analysis | |||
Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
Image analysis | Leica | LasX |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved