שיטת "חליבת המוח" לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים מחולדות חיות

Summary

שיטה לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים ממוחות של חולדות חיות מוצגת כאן בפירוט ניסיוני. הוא מאפשר אוספים מרובים של תאים אלה מאותם בעלי חיים מבלי לסכן את רווחתם.

Abstract

תאי גזע עצביים ספציפיים לרקמות (NSCs) נשארים פעילים במוח של יונקים לאחר הלידה. הם מתגוררים בנישות מיוחדות, שם הם מייצרים נוירונים חדשים וגלריה. נישה אחת כזו היא האזור התת-אפנדימלי (SEZ; נקרא גם האזור החדרי-תת-חדרי), הממוקם מעבר לדפנות הצידיות של החדרים הרוחביים, בסמוך לשכבת התא האפנדימלי. תאי אב אוליגודנדרוציטים (OPC) מופצים בשפע ברחבי מערכת העצבים המרכזית, ומהווים מאגר של תאי אב מתרבים שיכולים לייצר אוליגודנדרוציטים.

הן NSCs והן OPCs מציגים פוטנציאל התחדשות עצמית ומחזורי שקט/הפעלה. בשל מיקומם, הבידוד והחקירה הניסויית של תאים אלה מבוצעת לאחר המוות. כאן, אנו מתארים בפירוט "חליבת מוח", שיטה לבידוד של תאי גזע גזעיים ו- OPC, בין תאים אחרים, מבעלי חיים חיים. זהו פרוטוקול דו-שלבי המיועד לשימוש במכרסמים ונבדק בחולדות. ראשית, תאים "משתחררים" מהרקמה באמצעות הזרקה סטריאוטקסית תוך-מוחית (i.c.v.) של "קוקטייל שחרור". המרכיבים העיקריים הם neuraminidase, אשר מכוון תאים אפנדימליים וגורם denudation דופן החדר, נוגדן חוסם integrin-β1, וגורם גדילה פיברובלסט-2. בשלב "איסוף" שני, ביופסיות נוזליות של נוזל מוחי שדרתי מבוצעות מגנה cisterna, בחולדות מורדמות ללא צורך בחתך.

התוצאות המוצגות כאן מראות כי תאים מבודדים שומרים על הפרופיל האנדוגני שלהם וכי NSCs של SEZ שומרים על שלוותם. הדנודציה של שכבת האפנדימל מוגבלת לרמה האנטומית של ההזרקה והפרוטוקול (שחרור ואיסוף) נסבל היטב על ידי בעלי החיים. גישה חדשנית זו סוללת את הדרך לביצוע מחקרי אורך של נוירוגנזה אנדוגנית וגליוגנזה בחיות ניסוי.

Introduction

תאי גזע ספציפיים לרקמות הם תאים מחויבים חלקית שיכולים ליצור את כל אוכלוסיות התאים המרכיבות את הרקמות המתאימות. מלבד היותם מולטיפוטנטיים, הם תאים המתחדשים מעצמם וחיוניים לשמירה על ההומאוסטזיס ויכולת ההתחדשות של רקמות¹. חלק מתאי הגזע הספציפיים לרקמות נשארים במצב פעיל ומתרבים מאוד, כגון תאי גזע במעי או בהמטופויטיקה. אחרים, כגון תאי גזע המוח, נשארים שקטים או רדומים^{במידה רבה 2}. במוח הבוגר, תאי גזע עצביים (NSCs) יכולים להימצא באזורים מיוחדים, הנקראים לעתים קרובות נישות. שני אזורים כאלה המתוארים היטב קיימים באזור התת-אפנדימלי (SEZ) של החדרים הרוחביים ובפיתול המשונן של ההיפוקמפוס. נישת SEZ מייצרת את המספר הגבוה ביותר של תאים, בע....

Protocol

הליכי גידול, תחזוקה וניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לחוק הבריטי לבעלי חיים (הליכים מדעיים) 1986, שאושר על ידי משרד הפנים, ועם הצו הנשיאותי 56/2013 של הרפובליקה ההלנית, שנבחן על ידי גופי רווחת בעלי החיים והביקורת האתית של אוניברסיטאות קיימברידג 'ופטרס, וכן אושר ונבדק על ידי הוועדה המקומית לטיפול ?.......

Discussion

תאי גזע ותאי אב דלילים יחסית ברקמת המוח של יונקים. בנוסף, NSCs ממוקמים באזורים שאינם נגישים לביופסיות קלות ובטוחות (קירות חדר, היפוקמפוס). לכן, הדרך היחידה לעבוד באופן ניסיוני עם תאים כאלה, עד כה, הייתה הבידוד שלהם לאחר המוות. שיטה המאפשרת איסוף יחיד או חוזר של NSCs ו-OPC מחולדות חיות, הנקראת חליבה,.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX