Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שיטה לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים ממוחות של חולדות חיות מוצגת כאן בפירוט ניסיוני. הוא מאפשר אוספים מרובים של תאים אלה מאותם בעלי חיים מבלי לסכן את רווחתם.

Abstract

תאי גזע עצביים ספציפיים לרקמות (NSCs) נשארים פעילים במוח של יונקים לאחר הלידה. הם מתגוררים בנישות מיוחדות, שם הם מייצרים נוירונים חדשים וגלריה. נישה אחת כזו היא האזור התת-אפנדימלי (SEZ; נקרא גם האזור החדרי-תת-חדרי), הממוקם מעבר לדפנות הצידיות של החדרים הרוחביים, בסמוך לשכבת התא האפנדימלי. תאי אב אוליגודנדרוציטים (OPC) מופצים בשפע ברחבי מערכת העצבים המרכזית, ומהווים מאגר של תאי אב מתרבים שיכולים לייצר אוליגודנדרוציטים.

הן NSCs והן OPCs מציגים פוטנציאל התחדשות עצמית ומחזורי שקט/הפעלה. בשל מיקומם, הבידוד והחקירה הניסויית של תאים אלה מבוצעת לאחר המוות. כאן, אנו מתארים בפירוט "חליבת מוח", שיטה לבידוד של תאי גזע גזעיים ו- OPC, בין תאים אחרים, מבעלי חיים חיים. זהו פרוטוקול דו-שלבי המיועד לשימוש במכרסמים ונבדק בחולדות. ראשית, תאים "משתחררים" מהרקמה באמצעות הזרקה סטריאוטקסית תוך-מוחית (i.c.v.) של "קוקטייל שחרור". המרכיבים העיקריים הם neuraminidase, אשר מכוון תאים אפנדימליים וגורם denudation דופן החדר, נוגדן חוסם integrin-β1, וגורם גדילה פיברובלסט-2. בשלב "איסוף" שני, ביופסיות נוזליות של נוזל מוחי שדרתי מבוצעות מגנה cisterna, בחולדות מורדמות ללא צורך בחתך.

התוצאות המוצגות כאן מראות כי תאים מבודדים שומרים על הפרופיל האנדוגני שלהם וכי NSCs של SEZ שומרים על שלוותם. הדנודציה של שכבת האפנדימל מוגבלת לרמה האנטומית של ההזרקה והפרוטוקול (שחרור ואיסוף) נסבל היטב על ידי בעלי החיים. גישה חדשנית זו סוללת את הדרך לביצוע מחקרי אורך של נוירוגנזה אנדוגנית וגליוגנזה בחיות ניסוי.

Introduction

תאי גזע ספציפיים לרקמות הם תאים מחויבים חלקית שיכולים ליצור את כל אוכלוסיות התאים המרכיבות את הרקמות המתאימות. מלבד היותם מולטיפוטנטיים, הם תאים המתחדשים מעצמם וחיוניים לשמירה על ההומאוסטזיס ויכולת ההתחדשות של רקמות1. חלק מתאי הגזע הספציפיים לרקמות נשארים במצב פעיל ומתרבים מאוד, כגון תאי גזע במעי או בהמטופויטיקה. אחרים, כגון תאי גזע המוח, נשארים שקטים או רדומיםבמידה רבה 2. במוח הבוגר, תאי גזע עצביים (NSCs) יכולים להימצא באזורים מיוחדים, הנקראים לעתים קרובות נישות. שני אזורים כאלה המתוארים היטב קיימים באזור התת-אפנדימלי (SEZ) של החדרים הרוחביים ובפיתול המשונן של ההיפוקמפוס. נישת SEZ מייצרת את המספר הגבוה ביותר של תאים, בע....

Protocol

הליכי גידול, תחזוקה וניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לחוק הבריטי לבעלי חיים (הליכים מדעיים) 1986, שאושר על ידי משרד הפנים, ועם הצו הנשיאותי 56/2013 של הרפובליקה ההלנית, שנבחן על ידי גופי רווחת בעלי החיים והביקורת האתית של אוניברסיטאות קיימברידג 'ופטרס, וכן אושר ונבדק על ידי הוועדה המקומית לטיפול ?.......

Representative Results

שחרור ואיסוף של NSCs
NSCs של SEZ מופרדים מן CSF רק על ידי monolayer של תאים ependymal, אם כי הם נשארים בקשר ישיר עם התוכן החדר באמצעות intercalating mono-ciliated תהליכים 8,9. Neuraminidase פועל באופן ספציפי על תאים ependymal באמצעות מחשוף של שאריות חומצה sialic והוא יכול לגרום denudatio.......

Discussion

תאי גזע ותאי אב דלילים יחסית ברקמת המוח של יונקים. בנוסף, NSCs ממוקמים באזורים שאינם נגישים לביופסיות קלות ובטוחות (קירות חדר, היפוקמפוס). לכן, הדרך היחידה לעבוד באופן ניסיוני עם תאים כאלה, עד כה, הייתה הבידוד שלהם לאחר המוות. שיטה המאפשרת איסוף יחיד או חוזר של NSCs ו-OPC מחולדות חיות, הנקראת חליבה,.......

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר רפואי פעולה (בריטניה) (GN2291) ל- R.J.M.F. ו- I.K. עבודת המחקר נתמכה גם באופן חלקי (עלויות בעלי חיים ותמיכה ל- D.D) על ידי הקרן ההלנית למחקר וחדשנות (H.F.R.I.) תחת "קול קורא ראשון לפרויקטי מחקר של H.F.R.I לתמיכה בחברי סגל וחוקרים ורכישת מענק ציוד מחקר בעלות גבוהה" (מספר פרויקט: 3395).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibodyBD Biosciences#555002purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)Sigma-Aldrich#N2876Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)Peprotech#100-18Bkept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL SyringeHamilton#80330Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringesBD biosciences04085-0029 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30MLLAVIPHARM-CASTALIASKU: 5201048131168
BupaqRICHTERPHARMA1021854AF10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and MouseStoelting51500D
Homeothermic Monitoring SystemHarvard Apparatus55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquidVetpharma Animal Health32509/4031
KetamidorRICHTER PHARMASKU: 9004114002531Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, EthilonEthiconD9635Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical TrimmersStoeltingItem:51472
Scalpel blades, sterileSwann MortonAW050
Scopettes Jr.  8-inch SwabsBirchwood Laboratories34-7021-12P
Stereotaxic High Speed DrillForedom1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument KitStoeltingItem: 52189
Xylan 2%Chanelle Pharmaceuticals13764/03/19-5-2004Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopyGreiner#655866Screen star microplate
B27 supplementThermoFisher ScientificA1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)MerckP06-1391100Fraction V, heat shock
CitrateMerck71497Sodium citrate monobasic
CryostatLeicaCM1510S
DAPIMerck, Calbiochem28718-90-3Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEMThermoFisher Scientific11995065High glucose, pyruvate
donkey anti-goatBiotium20016 or 20106 or 20048Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouseBiotium20014 or 20105 or 20046Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbitBiotium20015 or 20098 or 20047Dilution: 1/1,000
EGFPeprotech315-09
FGF-2 (or bFGF)Peprotech100-18B
goat anti-GFAPAbcamab53554Dilution: 1/500
goat anti-SOX2Santa Cruz Biotecnologysc-17320Dilution: 1/200
mouse anti-ID3Santa Cruz Biotecnologysc-56712Dilution: 1/200
mouse anti-S100βSigmaS2532Dilution: 1/200
MowiolMerck, Calbiochem475904Mounting medium
N2 supplementThermoFisher Scientific17502048
ParafolmadehydeMerck158127
Poly-D-LysineMerck, MilliporeA-003-ESolution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)Abcamab18723Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRαAbcamab51875Dilution: 1/200
rabbit anti-β- cateninAbcamab16051Dilution: 1/500
Triton X-100MerckX100
Microscopy and image analysis
Confocal microscopeLeicaSP6 and SP8
Image analysisNIH, USAImageJ
Image analysisLeicaLasX

References

  1. Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
  2. Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem c....

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved