Il metodo di "mungitura del cervello" per l'isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti da ratti vivi

Summary

Un metodo per l'isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti dal cervello di ratti vivi è presentato qui in dettaglio sperimentale. Permette di raccogliere più cellule dagli stessi animali senza comprometterne il benessere.

Abstract

Le cellule staminali neurali tessuto-specifiche (NSC) rimangono attive nel cervello postnatale dei mammiferi. Risiedono in nicchie specializzate, dove generano nuovi neuroni e glia. Una di queste nicchie è la zona subependimale (SEZ; chiamata anche zona ventricolare-subventricolare), che si trova lungo le pareti laterali dei ventricoli laterali, adiacente allo strato cellulare ependimale. Le cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) sono abbondantemente distribuite in tutto il sistema nervoso centrale, costituendo un pool di cellule progenitrici proliferative che possono generare oligodendrociti.

Sia le NSC che le OPC mostrano un potenziale di auto-rinnovamento e cicli di quiescenza/attivazione. A causa della loro posizione, l'isolamento e l'indagine sperimentale di queste cellule viene eseguita post mortem. Qui descriviamo in dettaglio la "mungitura cerebrale", un metodo per l'isolamento di NSC e OPC, tra le altre cellule, da animali vivi. Si tratta di un protocollo in due fasi progettato per l'uso nei roditori e testato nei ratti. In primo luogo, le cellule vengono "rilasciate" dal tessuto tramite iniezione intracerebroventricolare stereotassica (i.c.v.) di un "cocktail di rilascio". I componenti principali sono la neuraminidasi, che prende di mira le cellule ependimali e induce la denudazione della parete ventricolare, un anticorpo bloccante l'integrina-β1 e il fattore di crescita dei fibroblasti-2. In una seconda fase di "raccolta" vengono eseguite biopsie liquide di liquido cerebrospinale dalla cisterna magna, in ratti anestetizzati senza necessità di incisione.

I risultati qui presentati mostrano che le cellule isolate mantengono il loro profilo endogeno e che le NSC della ZES conservano la loro quiescenza. La denudazione dello strato ependimale è limitata al livello anatomico dell'iniezione e il protocollo (rilascio e raccolta) è ben tollerato dagli animali. Questo nuovo approccio apre la strada all'esecuzione di studi longitudinali sulla neurogenesi endogena e sulla gliogenesi negli animali da esperimento.

Introduction

Le cellule staminali tessuto-specifiche sono cellule parzialmente impegnate che possono dare origine a tutte le popolazioni cellulari che costituiscono i rispettivi tessuti. Oltre ad essere multipotenti, sono cellule che si autorinnovano e sono fondamentali per mantenere l'omeostasi e la capacità rigenerativa dei tessuti¹. Alcune cellule staminali tessuto-specifiche rimangono in uno stato attivo e fortemente proliferativo, come le cellule staminali intestinali o ematopoietiche. Altri, come le cellule staminali cerebrali, rimangono in gran parte quiescenti o dormienti². Nel cervello adulto, le cellule staminali neurali (N....

Protocol

L'allevamento, il mantenimento e le procedure sperimentali degli animali sono stati condotti in conformità con l'UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986, autorizzato dal Ministero dell'Interno, e con il Decreto Presidenziale 56/2013 della Repubblica Ellenica, esaminati dagli Organi di Revisione Etica e per il Benessere degli Animali delle Università di Cambridge e Patrasso, nonché approvati e controllati dal Comitato locale per la cura e l'uso degli animali della Prefettura (Numero di protocollo: 5675/39/18-01-20.......

Discussion

Le cellule staminali e progenitrici sono relativamente scarse nel tessuto cerebrale dei mammiferi. Inoltre, le NSC sono localizzate in aree inaccessibili per biopsie facili e sicure (pareti ventricolari, ippocampo). Pertanto, l'unico modo per lavorare sperimentalmente con tali cellule, finora, è stato il loro isolamento post mortem. Un metodo che consente la raccolta singola o ripetuta di NSC e OPC da ratti vivi, chiamato mungitura, è descritto qui passo dopo passo. Il metodo si basa su due caratteristiche chiave: i) l.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX