Перевязка левого предсердия у эмбриона птицы как модель измененной гемодинамической нагрузки при раннем развитии сосудов

Резюме

Здесь мы представляем подробный визуальный протокол выполнения модели перевязки левого предсердия (LAL) у эмбриона птицы. Модель LAL изменяет внутрисердечный поток, который изменяет напряженную нагрузку при сдвиге стенки, имитируя синдром гипоплазии левых отделов сердца. Представлен подход к преодолению трудностей, связанных с этой сложной моделью микрохирургии.

Аннотация

Благодаря своей четырехкамерной конфигурации зрелого желудочка, простоте культивирования, доступу к визуализации и эффективности, птичий эмбрион является предпочтительной моделью позвоночных животных для изучения сердечно-сосудистого развития. В исследованиях, направленных на понимание нормального развития и прогноза врожденных пороков сердца, широко используется эта модель. Микроскопические хирургические методы используются для изменения нормальной механической нагрузки в определенный момент времени эмбриона и отслеживания нисходящего молекулярно-генетического каскада. Наиболее распространенными механическими вмешательствами являются перевязка левой вителлиновой вены, конотранкальное бандажирование и перевязка левого предсердия (LAL), модулирующая внутрисосудистое давление и напряжение сдвига стенки из-за кровотока. LAL, особенно если она выполняется в яйцеклетке, является наиболее сложным вмешательством, с очень малым выходом образцов из-за чрезвычайно тонких последовательных микрохирургических операций. Несмотря на высокий риск, in ovo LAL очень ценен с научной точки зрения, поскольку имитирует патогенез синдрома гипоплазии левых отделов сердца (СГЛО). СГЛОС является клинически значимым сложным врожденным пороком сердца, наблюдаемым у новорожденных. Подробный протокол для in ovo LAL описан в этой статье. Вкратце, оплодотворенные эмбрионы птиц инкубировали при температуре 37,5 °C и постоянной влажности 60%, как правило, до тех пор, пока они не достигали стадий Гамбурга-Гамильтона (HH) со 20 по 21. Скорлупа яиц была вскрыта, а внешняя и внутренняя оболочки удалены. Эмбрион осторожно поворачивали, чтобы обнажить луковицу левого предсердия общего предсердия. Предварительно собранные микроузлы из нейлоновых нитей 10-0 аккуратно располагались и завязывались вокруг почки левого предсердия. Наконец, эмбрион был возвращен в исходное положение, и LAL была завершена. Нормальный желудочек и желудочки с LAL-инструментами продемонстрировали статистически значимые различия в уплотнении тканей. Эффективная генерация моделей LAL будет способствовать исследованиям, посвященным синхронизированным механическим и генетическим манипуляциям во время эмбрионального развития сердечно-сосудистых компонентов. Кроме того, эта модель обеспечит возмущенный клеточный источник для исследований тканевых культур и сосудистой биологии.

Введение

Врожденные пороки сердца (ВПС) – это структурные нарушения, возникающие из-за аномального эмбрионального развития¹. Помимо генетических условий, на патогенез влияет измененная механическая нагрузка ^2,3. Синдром гипоплазии левых отделов сердца (СГЛОС), врожденный порок сердца, приводит к недоразвитию желудочка/аорты при рождении⁴ с высоким уровнем смертности ^5,6. Несмотря на недавние успехи в клиническом лечении, динамика роста и развития сосудов при СГЛОС до сих пор неясна⁷. При но....

протокол

Оплодотворенные белые яйца леггорнов получают от проверенных поставщиков и инкубируют в соответствии с утвержденными университетом рекомендациями. Эмбрионы цыплят на стадиях с 18 (3-й день) по 24-й (4-й день) (стадии, представленные в этой статье) не считаются живыми позвоночными животными в соответствии с директивой Европейского союза (ЕС) 2010/63/EU и рекомендациями Комитета по уходу и использованию животных (IACUC) в США. Эмбрионы цыплят считаются «живыми животными» после 19-го дня инкубации в соответствии с законами США, но не для ЕС. Каждое яйцо маркируется датой начала вылупления и планируется к вылуплению не позднее^10-го дня инкубации. После того, ка....

Результаты

Для наблюдения за структурными и морфологическими изменениями, вызванными вмешательством LAL¹⁰, могут быть использованы передовые методы визуализации с временным разрешением. Кроме того, образцы LAL также поддаются молекулярным и биологическим методам^19,28.......

Обсуждение

При СГЛОС кровоток изменяется из-за структурных дефектов, что приводит к аномальной морфологии с левой стороны ^4,6. Данная модель представляет собой практическую экспериментальную систему, позволяющую лучше понять прогрессирование СГЛОС и даже имитиров.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo