A Preparação Ex Vivo do Corte da Medula Espinhal para o Registro de Patch-Clamp de Células Inteiras em Neurônios Motores Durante a Estimulação da Medula Espinhal

Summary

Este protocolo descreve um método que utiliza um patch-clamp para estudar as respostas elétricas dos neurônios motores à estimulação da medula espinhal (SCS) com alta resolução espaço-temporal, o que pode ajudar os pesquisadores a melhorar suas habilidades em separar a medula espinhal e manter a viabilidade celular simultaneamente.

Abstract

A estimulação da medula espinhal (ECS) pode efetivamente restaurar a função locomotora após a lesão medular (LME). Como os neurônios motores são a unidade final para executar comportamentos sensório-motores, estudar diretamente as respostas elétricas dos neurônios motores com SCS pode nos ajudar a entender a lógica subjacente da modulação motora espinhal. Para registrar simultaneamente diversas características de estímulos e respostas celulares, um patch-clamp é um bom método para estudar as características eletrofisiológicas em escala unicelular. No entanto, ainda existem algumas dificuldades complexas para atingir esse objetivo, incluindo a manutenção da viabilidade celular, a separação rápida da medula espinhal da estrutura óssea e o uso do SCS para induzir com sucesso potenciais de ação. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado usando patch-clamp para estudar as respostas elétricas dos neurônios motores à SCS com alta resolução espaço-temporal, o que pode ajudar o pesquisador a melhorar suas habilidades em separar a medula espinhal e manter a viabilidade celular, ao mesmo tempo em que estuda suavemente o mecanismo elétrico da SCS no neurônio motor e evitar tentativas e erros desnecessários.

Introduction

A estimulação da medula espinhal (ECS) pode efetivamente restaurar a função locomotora após a lesão medular (LME). Andreas Rowald e col. relataram que a ECS possibilita a função locomotora e do tronco dos membros inferiores em um único dia¹. Explorar o mecanismo biológico da SCS para recuperação locomotora é um campo de pesquisa crítico e de tendência para o desenvolvimento de uma estratégia SCS mais precisa. Por exemplo, a equipe de Grégoire Courtine demonstrou que o interneurônio excitatório Vsx2 e os neurônios Hoxa10 na medula espinhal são os neurônios-chave para responder à SCS, e a neuromodulação célula-específica é viável para restaurar a....

Protocol

O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais aprovou todos os experimentos com animais e os estudos foram conduzidos de acordo com as normas pertinentes de bem-estar animal.

1. Preparação dos animais

1. Animais
   1. Informações sobre alojamento: Ratos Sprague-Dawley machos domésticos (10-14 dias pós-natal, P10-P14) em um ambiente específico livre de patógenos.
      NOTA: As condições da sala foram mantidas em 20 °C ± 2 °C, umidade: 50%-60%, com um c.......

Discussion

A informação do movimento modulada pela SCS é finalmente convergente para os neurônios motores. Portanto, tomar os neurônios motores como alvo da pesquisa pode simplificar o desenho do estudo e revelar o mecanismo de neuromodulação da SCS mais diretamente. Para registrar simultaneamente diversas características de estímulos e respostas celulares, um patch-clamp é um bom método para estudar as características eletrofisiológicas em escala unicelular. No entanto, ainda existem algumas dificuldades, incluindo co.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
Choline Chloride	Sigma	C7527
Cover slide tweezers	VETUS	36A-SA	Clip a slice
D-Glucose	Sigma	G8270
EGTA	Sigma	E4378
Fine scissors	RWD Life Science	S12006-10	Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source	Olympus	U-HGLGPS
Fluoro-Gold	Fluorochrome	Fluorochrome	Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877
HEPES	Sigma	H3375
infrared CCD camera	Dage-MTI	IR-1000E
KCl	Sigma	P5405
K-gluconate	Sigma	P1847
Low melting point agarose	Sigma	A9414
MgSO4·7H2O	Sigma	M2773
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-200
Micropipette puller	Sutter instrument	P1000
Micro-scissors	Jinzhong	wa1020	Laminectomy
Microscope for anatomy	Olympus	SZX10
Microscope for ecletrophysiology	Olympus	BX51WI
Micro-toothed tweezers	RWD Life Science	F11008-09	Lift the cut vertebral body
NaCl	Sigma	S5886
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	V900182
Na-Phosphocreatine	Sigma	P7936
Objective lens for ecletrophysiology	Olympus	LUMPLFLN60XW	working distance 2 mm
Osmometer	Advanced	FISKE 210
Patch-clamp amplifier	Axon	Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer	Axon	Digidata 1550B
pH meter	Mettler Toledo	FE28
Slice Anchor	Multichannel system	SHD-27H
Spinal cord stimulatior	PINS	T901
Toothed tweezer	RWD Life Science	F13030-10	Lift the xiphoid
Vibratome	Leica	VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter	Olympus	U-MF2